目的:構(gòu)建乙腦病毒（JEV）野毒株SA14包膜蛋白K279M突變病毒感染性克隆,拯救病毒,并用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討JEV包膜蛋白279位氨基酸突變對(duì)病毒神經(jīng)毒力的影響。方法:以JEV包膜蛋白cDNA為模板,用重疊延伸PCR技術(shù)與分子克隆技術(shù)構(gòu)建含有rJEV SA14包膜蛋白279位氨基酸,由賴氨酸（K）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕）的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pACNR-JEV SA14（K279M）,并以其為模板體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA,轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝得到恢復(fù)病毒JEV SA14（K279M）。用蝕斑實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)以及病毒測(cè)序等方法鑒定恢復(fù)病毒。比較恢復(fù)病毒JEV SA14（K279M）和rJEV SA14、突變株JEV SA14-14-2（M279K）、乙腦疫苗株（rJEV SA14-14-2）的蝕斑大小、生長(zhǎng)特點(diǎn)以及對(duì)昆明鼠和7日齡乳鼠的神經(jīng)毒力等方面的差異。結(jié)果:感染性克隆經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定表明已成功構(gòu)建。病毒測(cè)序結(jié)果表明:恢復(fù)病毒JEV SA14（K279M）除在1813位堿基處人為引入A→T的突變（導(dǎo)致K279M突變）外,未發(fā)生其它突變。經(jīng)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí),恢復(fù)病毒JEV SA14... 

【文章來(lái)源】：川北醫(yī)學(xué)院四川省

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

含E279突變的JEVSA14（K279M）感染性克隆的構(gòu)建Fig1.ConstructionflowchartofinfectioncloneofJEVSA14(K279M)virus

圖 2 重疊延伸 pcr 技術(shù)擴(kuò)增含 279 突變 DNA 片段示意圖Fig2. Construction flow chart of 279 mutated DNAfragments by SOE PCR.2.1.3 prM/E (K279M)片段的 T-A 克隆及測(cè)序鑒定① 連接反應(yīng)將回收的DNA片段與pMD-19T載體按表2進(jìn)行體外連接，4℃過(guò)夜pMD-19 T Vector 1.0ulSolution I 5.0ulH2O 2.0ul② 藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)將 X-Gal（20mg/ml）、IPTG（1mol/l）、LB 液體培養(yǎng)基按比例 40ulul：100ul 混合，均勻涂布在 LB 固體培養(yǎng)基平板（含有 100mg/ml AM

及死亡情況 14d，其中，前 3 天死亡 法分別計(jì)算 JEV SA14-14-2 (M279 擴(kuò)增含 E279 突變的 prM/E 片段E279R 配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物約為 1400bp， 800bp，用引物 F2 和 R3 配對(duì)擴(kuò)增乳鼠，每組 6 只，每只乳鼠接種

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]乙腦病毒野毒株SA14感染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救[J]. 冷生玲,黃榮,馮亞嵐,唐麗萍,周仲輝,陳大斌,楊健.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2018(09)
[2]乙型腦炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回復(fù)突變對(duì)其毒力的影響[J]. 楊健,李玉華,李竹石,林華,汪偉,劉麗娜,倪謙枝,曾獻(xiàn)武,楊會(huì)強(qiáng).  川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2013(04)
[3]乙型腦炎病毒SA14-14-2減毒疫苗株的生物學(xué)和基因穩(wěn)定性[J]. 許樂(lè)燕,徐聞青,徐帆洪,王兵,張秀娟.  中國(guó)生物制品學(xué)雜志. 2008(10)



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