大豆是重要的油料兼經(jīng)濟(jì)作物。大豆油中富含多不飽和脂肪酸,容易被氧化。油酸作為一種單不飽和脂肪酸,是大豆油的重要組成部分,它性質(zhì)穩(wěn)定、不容易被氧化,在人體的脂類代謝中能降低有害膽固醇,保持有益膽固醇,從而減緩動(dòng)脈粥樣硬化,有效預(yù)防心血管疾病發(fā)生的幾率。因此,油酸含量是評(píng)價(jià)大豆油脂品質(zhì)的重要指標(biāo),高油酸大豆育種是大豆品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。在脂肪酸合成途徑中,Δ¹²-脂肪酸脫飽和酶（FAD2）是催化油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵酶。FAD2-1A和FAD2-1B基因主要在發(fā)育的種子中表達(dá),并被認(rèn)為在控制種子油酸含量中起著重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向編輯控制油酸含量的兩個(gè)關(guān)鍵基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B,創(chuàng)制大豆FAD2-1基因突變體,為高油酸育種提供了新的種質(zhì)資源并創(chuàng)建了方法。主要研究結(jié)果如下:1.根據(jù)大豆GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的序列,同時(shí)設(shè)計(jì)了3個(gè)分別由AtU3d、AtU3b和AtU6-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)、長(zhǎng)20 bp的guide RNA（gRNA）靶點(diǎn)以靶向編輯GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的外顯子區(qū),并且將這... 

【文章來(lái)源】：廣州大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖2-13個(gè)靶點(diǎn)分別在GmFAD2-1基因內(nèi)的位置

第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法暗條件下培養(yǎng) 20 d 左右。發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1 L）：1/2 MS，MES 0.6脂 8 g，250 mg L-1頭孢，250 mg L-1羧芐霉素，PH=5.8。轉(zhuǎn) pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA 大豆毛狀根的篩選及培養(yǎng)發(fā) 5~7 d 后，選取綠色的大豆無(wú)菌苗，將獲得的大豆子葉節(jié)外植體放入 中 ， 用 制 備 好 的 農(nóng) 桿 菌 K599 菌 液 pYLCRISPR/Cas9-FAD2RISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA-1，pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA-2）侵25℃，16 h/8 h 光暗條件下培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出毛狀根，轉(zhuǎn)化過(guò)程如下（圖

圖 3-2 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建第二輪 PCR 擴(kuò)增；M：DNA marker（DM2000）；1：是含有第 1 有第 2 個(gè)靶位點(diǎn)的 AtU3b 表達(dá)盒；3：是含有第 3 個(gè)靶位點(diǎn)的 A泳；M：DNA marker（DM2000）；1：H2O 空白對(duì)照；2：pYL2-1 基因敲除陽(yáng)性單菌落。D：Asc I 酶切鑒定 pYLCRISPR/Cas9M：1 kb DNA ladder marker；1：pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRN. 3-2 Construction of pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA expression d second rounds of PCR amplification; M: DNA marker (DM2000); 1ntaing the second target site; 3: containg the three target site. C: electry; M: DNA marker (DM2000); 1: H2O blank control; 2: pYLCRISPR/-7: FAD2-1 gene knockout positive single clones. D: identification of R/Cas9-FAD2-1-gRNA plasmid digested with Asc I; M: 1 kb DNA ladpYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA.

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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