發(fā)布時間：2021-02-09 21:20

　　5-甲基胞嘧啶（m5C）作為RNA的一種普遍的修飾近年來得到廣泛的關注。越來越多的研究表明,RNAm5C修飾在RNA加工、RNA穩(wěn)定性、RNA出核轉運以及mRNA翻譯等過程中起到重要作用。NSUN2（NOP2/Sun domain family,member 2）是哺乳動物RNAm5C甲基轉移酶之一,主要負責tRNA和mRNA的甲基化。最近研究表明,NSUN2參與調節(jié)生物體的發(fā)育及疾病的發(fā)生,如細胞增殖、干細胞分化、腦和睪丸發(fā)育以及腫瘤發(fā)生等。但對NSUN2在生物體發(fā)育和疾病發(fā)生中的作用和功能及其分子機制仍不甚明了。本研究以腎小管上皮細胞系HEK293和肝癌細胞系HepG2為研究模型,通過CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術敲除NSUN2基因,觀察NSUN2敲除后細胞的表型、基因表達和mRNA m5C修飾的變化,進而闡明NSUN2基因及其RNA m5C修飾的生物學功能和作用。1.利用CRISPR/Cas9技術建立RNA m5C甲基轉移酶NSUN2基因缺失型HEK293和HepG2細胞系本研究通過CRISPR/Cas9技術介導的同源重組將抗性篩選標記（NeoR和PuroR）及轉錄終止... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：147 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２－１?ＮＳＵＮ２去表達細胞系建立示意圖

圖２－２?Ｄｏｎｏｒ載體工作原理示意圖。Ｃａｓ９切割基因組靶位點后，Ｄｏｎｏｒ載體利用同源修復機制，將左??右同源臂中間的篩選基因和轉錄終止信號從切割位點整合入基因組。??Ｆｉｇ．２－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｄｏｎｏｒ?ｖｅｃｔｏｒ．?Ａｆｔｅｒ?ｔａｒｇｅｔ?ｓｉｔｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｗａｓ?ｃｕｔｔｅｄ?ｂｙ?Ｃａｓ９?ｐｒｏｔｅｉｎ，?ｄｏｎｏｒ??ｃａｒｒｉｅｒｓ?ｉｎｔｅｇｒａｔｅ?ｔｈｅ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｇｅｎｅｓ?ａｎｄ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ?ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｔｈｅ?ｌｅｆｔ?ａｎｄ?ｒｉｇｈｔ??ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ?ａｒｍ?ｉｎｔｏ?ｔｈｅ?ｃｕｔｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｔｈｒｏｕｇｈ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｐａｉｒ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．??Ｄｏｎｏｒ載體骨架為Ｔ?ｅａｓｙ?ｖｅｃｔｏｒ－ｍｕｌｔｉ－５，是由Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ改造而來，其中插入一段有兩??個＆ｗＢｌ酶切位點的序列。Ｄｏｎｏｒ序列主要組成為ＮＳＵＮ２－ＬＲ?（左同源臂）、Ｔ２Ａ－篩選基因??和？《／＃）、轉錄終止信號（ＢＧＨｐｌｏｙ（Ａ）?ｓｉｇｎａｌ）、ＮＳＵＮ２－ＲＲ?（右同源臂）。主要構建??方法如下：??（１）左右同源臂的擴增，左右同源臂分別擴增于ＮＳＵＮ２基因ｇＲＮＡ切割位點上游和下游??各８００?ｂｐ序列，引物如下：???引物名稱?序列（５，－３，）???ＨＡＬ－Ｂｓａ?１?－Ｆ?ＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣ?ＡＧＣＧＣＧ??

４．１成功構建針對人ＮＳＵＮ２基因的ｓｇＲＮＡ??本文利用在線網(wǎng)站在ＮＳＵＮ２基因第一和第二外顯子上設計并挑選出５個錯配率低的??ｇＲＮＡ位點（圖２－３）。為檢測各ｓｇＲＮＡ的定位效率，我們將ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９質粒共轉染至??ＨＥＫ２９３細胞系，在提取基因組和ＰＣＲ擴增靶序列后，用Ｔ７Ｅ１酶切法確定各位點切割效??率。??Ｔｅ＊ｔ－Ｆ?Ｔｅｔｔ－Ｒ??Ｈｈ－ｆ?＋?Ｉ－－－４?１?１－?４?Ｈ－．?ｌ?轚Ｉ?Ｉ－Ｉ?Ｉ?Ｉ－?？??ｇｌＬＮＡ初卿??ｗ??ｇＲＮＡ－４??ｆＲＮＡ－ｌ??ｊ??｜ＲＮＡ－Ｓ?Ｈｏｍｏ?ｓｄｐｉｅｉｉ？?ＮＯＰ？?Ｓｕｎ?ＲＮＡ?ｍｅｌｈｙｔｔｒ？ｎ？ｆ＜＾ｒｄｓｃ?ｆ＾ｍ＆ｙ?ｍｅｍｂｅｒ?７?（ＮＳＵＮ？）??圖２－３?ｇＲＮＡ位點和檢測引物在ＮＳＵＮ２基因組上位置示意圖。??Ｆｉｇ．２－３?Ｔｈｅ?ｌｏｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇＲＮＡ?ｌｏｃｉ?ａｎｄ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｉｎ?ＮＳＵＮ２?ｇｅｎｅ．??


本文編號：3026253