藍細菌糖原代謝動態(tài)調(diào)控和生理功能研究
發(fā)布時間：2021-02-03 23:33
作為光合自養(yǎng)型原核生物,藍細菌能夠利用光合作用固定二氧化碳并將其作為碳源用于合成有機化合物。來自光合作用的大量碳源和能量除了用于細胞生長和代謝活動外,很大一部分將以糖原的形式作為藍細菌天然碳匯物質(zhì)而存在。而以藍細菌為底盤構(gòu)建的光驅(qū)固碳細胞工廠為了提高目標化合物的產(chǎn)量,需要將藍細菌中的碳源更多地重定向至目標化合物的合成途徑,以此為目標,糖原合成途徑的改造和調(diào)控成為藍細菌代謝工程的重要選擇。調(diào)節(jié)控制藍細菌的糖原合成、實現(xiàn)碳流的重定向成為優(yōu)化細胞工廠效率的主要策略。本研究以常用于光合細胞工廠開發(fā)的藍細菌模式藻株聚球藻PCC7942為出發(fā)藻株,以其糖原合成途徑的關(guān)鍵限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（GlgC）為改造靶點,利用茶堿響應型核糖開關(guān)對glgC的表達、糖原的合成進行調(diào)控,并進一步探索糖原合成量改變是否會引起細胞生理功能的變化。通過核糖開關(guān)調(diào)控的方法,能夠?qū)矍蛟錚CC7942的糖原合成量實現(xiàn)上下調(diào)控:減少糖原合成量時,聚球藻PCC7942細胞在正常條件下的生理功能和生長狀態(tài)并沒有受到損害,但細胞耐受性在面臨環(huán)境脅迫時明顯降低,無法維持正常生長;當糖原合成量通過改變茶堿濃度誘導增加時,聚球...
【文章來源】：中南林業(yè)科技大學湖南省
【文章頁數(shù)】：73 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖２．１茶堿響應核糖開關(guān)工作原理示意圖（Ａ）和核苷酸序列（Ｂ）?［９４］??．ｍｍｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｇｅｎｅ；?ＰｇｌｇＣ，?ｎａｔｉｖｅ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｇｌｇＣ??轉(zhuǎn)化聚球藻ＰＣＣ７９４２后，涂布卡那霉素抗性平板獲得的轉(zhuǎn)化子的??ＰＣＲ鑒定結(jié)果如圖２．３所示，無插入片段的野生型條帶大小為２．２ｋｂ，包??含了插入片段的轉(zhuǎn)化子具有的條帶大小為４．２ｋｂ。并且，在轉(zhuǎn)化子條帶中??看不到野生型條帶，證明整合完全，說明在聚球藻ＰＣＣ７９４２中成功于??ｇ／ｇＣ基因上游插入茶堿響應核糖開關(guān)。我們將轉(zhuǎn)化藻株命名為聚球藻??ＳｙｗｅｃＺ／ｏｃｏｃｃｗｓ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１，下文簡稱?ＸＣ１。??ＸＣ１?ＷＴ??５ｋ－？—＊??４ｋ－一??３ｋ－￣＊????ｍｍ??２?ｋ—??圖２．３工程藻株ＸＣｌ和對照藻株ＷＴ７９４２的基因型鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｇｅｎｏｔｙｐｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１?ａｎｄ?ＰＣＣ７９４２－ＷＴ?ｂｙ?ＰＣＲ．??２７??
驗證在工程藻株ＸＣ１中茶堿響應核糖開關(guān)的可行性，我們選擇蛋白免疫??印跡（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ）對轉(zhuǎn)化藻株進行檢測。??藍細菌蛋白提取后的濃度測定所采用標準曲線如圖２．４所示，并根??據(jù)待測樣品的最低濃度，將所有樣品的蛋白濃度調(diào)整為一致，保證后續(xù)??蛋白免疫印跡實驗上樣時具有相同的蛋白總量。??蛋白免疫印跡結(jié)果如圖２．５所示：通過蛋白免疫印跡結(jié)果可以看出，??對照藻株ＷＴ７９４２的ＧｌｇＣ蛋白豐度在不同茶堿濃度下所產(chǎn)生的區(qū)別較??小，茶堿濃度的遞增對ＧｌｇＣ蛋白的表達量沒有太大影響。而茶堿響應核??糖開關(guān)調(diào)控ｇ／ｇＣ基因的工程藻株ＸＣ１在不同茶堿濃度下的ＧｌｇＣ蛋白??表達量具有較大差異：在無茶堿誘導（ＴＯ）時，蛋白豐度上要遠遠低于??ＷＴ７９４２；隨著茶堿濃度增加至ｌｌＯｐＭ?（Ｔ１１０）時，ＧｌｇＣ蛋白豐度出現(xiàn)??了明顯的提高，在茶堿濃度提高為ｌｌＯＯｐＭ?（Ｔ１１００）時，ＧｌｇＣ蛋白豐度??則明顯高于ＷＴ７９４２。這說明茶堿對于ＷＴ７９４２藻株的影響較小，同時??插入茶堿響應核糖開關(guān)的工程藻株ＸＣ１通過外源茶堿濃度的改變成功??實現(xiàn)了在翻譯水平上對ＧｌｇＣ蛋白的誘導調(diào)控。??０．８????ｙ?＝?１．７４２９Ｘ?＋?０．０２９８??０７?－?ＲＪ?＝?０．９９２５??０．６?－??的?〇．５?－??ｑ＞?？？？？??０．
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Sucrose Secreted by the Engineered Cyanobacterium and Its Fermentability[J]. DUAN Yangkai,LUO Quan,LIANG Feiyan,LU Xuefeng. Journal of Ocean University of China. 2016(05)
本文編號：3017340
【文章來源】：中南林業(yè)科技大學湖南省
【文章頁數(shù)】：73 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖２．１茶堿響應核糖開關(guān)工作原理示意圖（Ａ）和核苷酸序列（Ｂ）?［９４］??．ｍｍｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｇｅｎｅ；?ＰｇｌｇＣ，?ｎａｔｉｖｅ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｇｌｇＣ??轉(zhuǎn)化聚球藻ＰＣＣ７９４２后，涂布卡那霉素抗性平板獲得的轉(zhuǎn)化子的??ＰＣＲ鑒定結(jié)果如圖２．３所示，無插入片段的野生型條帶大小為２．２ｋｂ，包??含了插入片段的轉(zhuǎn)化子具有的條帶大小為４．２ｋｂ。并且，在轉(zhuǎn)化子條帶中??看不到野生型條帶，證明整合完全，說明在聚球藻ＰＣＣ７９４２中成功于??ｇ／ｇＣ基因上游插入茶堿響應核糖開關(guān)。我們將轉(zhuǎn)化藻株命名為聚球藻??ＳｙｗｅｃＺ／ｏｃｏｃｃｗｓ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１，下文簡稱?ＸＣ１。??ＸＣ１?ＷＴ??５ｋ－？—＊??４ｋ－一??３ｋ－￣＊????ｍｍ??２?ｋ—??圖２．３工程藻株ＸＣｌ和對照藻株ＷＴ７９４２的基因型鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｇｅｎｏｔｙｐｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１?ａｎｄ?ＰＣＣ７９４２－ＷＴ?ｂｙ?ＰＣＲ．??２７??
驗證在工程藻株ＸＣ１中茶堿響應核糖開關(guān)的可行性，我們選擇蛋白免疫??印跡（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ）對轉(zhuǎn)化藻株進行檢測。??藍細菌蛋白提取后的濃度測定所采用標準曲線如圖２．４所示，并根??據(jù)待測樣品的最低濃度，將所有樣品的蛋白濃度調(diào)整為一致，保證后續(xù)??蛋白免疫印跡實驗上樣時具有相同的蛋白總量。??蛋白免疫印跡結(jié)果如圖２．５所示：通過蛋白免疫印跡結(jié)果可以看出，??對照藻株ＷＴ７９４２的ＧｌｇＣ蛋白豐度在不同茶堿濃度下所產(chǎn)生的區(qū)別較??小，茶堿濃度的遞增對ＧｌｇＣ蛋白的表達量沒有太大影響。而茶堿響應核??糖開關(guān)調(diào)控ｇ／ｇＣ基因的工程藻株ＸＣ１在不同茶堿濃度下的ＧｌｇＣ蛋白??表達量具有較大差異：在無茶堿誘導（ＴＯ）時，蛋白豐度上要遠遠低于??ＷＴ７９４２；隨著茶堿濃度增加至ｌｌＯｐＭ?（Ｔ１１０）時，ＧｌｇＣ蛋白豐度出現(xiàn)??了明顯的提高，在茶堿濃度提高為ｌｌＯＯｐＭ?（Ｔ１１００）時，ＧｌｇＣ蛋白豐度??則明顯高于ＷＴ７９４２。這說明茶堿對于ＷＴ７９４２藻株的影響較小，同時??插入茶堿響應核糖開關(guān)的工程藻株ＸＣ１通過外源茶堿濃度的改變成功??實現(xiàn)了在翻譯水平上對ＧｌｇＣ蛋白的誘導調(diào)控。??０．８????ｙ?＝?１．７４２９Ｘ?＋?０．０２９８??０７?－?ＲＪ?＝?０．９９２５??０．６?－??的?〇．５?－??ｑ＞?？？？？??０．
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Sucrose Secreted by the Engineered Cyanobacterium and Its Fermentability[J]. DUAN Yangkai,LUO Quan,LIANG Feiyan,LU Xuefeng. Journal of Ocean University of China. 2016(05)
本文編號：3017340
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