作為光合自養(yǎng)型原核生物,藍(lán)細(xì)菌能夠利用光合作用固定二氧化碳并將其作為碳源用于合成有機(jī)化合物。來(lái)自光合作用的大量碳源和能量除了用于細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)外,很大一部分將以糖原的形式作為藍(lán)細(xì)菌天然碳匯物質(zhì)而存在。而以藍(lán)細(xì)菌為底盤構(gòu)建的光驅(qū)固碳細(xì)胞工廠為了提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量,需要將藍(lán)細(xì)菌中的碳源更多地重定向至目標(biāo)化合物的合成途徑,以此為目標(biāo),糖原合成途徑的改造和調(diào)控成為藍(lán)細(xì)菌代謝工程的重要選擇。調(diào)節(jié)控制藍(lán)細(xì)菌的糖原合成、實(shí)現(xiàn)碳流的重定向成為優(yōu)化細(xì)胞工廠效率的主要策略。本研究以常用于光合細(xì)胞工廠開發(fā)的藍(lán)細(xì)菌模式藻株聚球藻PCC7942為出發(fā)藻株,以其糖原合成途徑的關(guān)鍵限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（GlgC）為改造靶點(diǎn),利用茶堿響應(yīng)型核糖開關(guān)對(duì)glgC的表達(dá)、糖原的合成進(jìn)行調(diào)控,并進(jìn)一步探索糖原合成量改變是否會(huì)引起細(xì)胞生理功能的變化。通過(guò)核糖開關(guān)調(diào)控的方法,能夠?qū)矍蛟錚CC7942的糖原合成量實(shí)現(xiàn)上下調(diào)控:減少糖原合成量時(shí),聚球藻PCC7942細(xì)胞在正常條件下的生理功能和生長(zhǎng)狀態(tài)并沒(méi)有受到損害,但細(xì)胞耐受性在面臨環(huán)境脅迫時(shí)明顯降低,無(wú)法維持正常生長(zhǎng);當(dāng)糖原合成量通過(guò)改變茶堿濃度誘導(dǎo)增加時(shí),聚球... 

【文章來(lái)源】：中南林業(yè)科技大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１茶堿響應(yīng)核糖開關(guān)工作原理示意圖（Ａ）和核苷酸序列（Ｂ）?［９４］??．ｍｍｎ

ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｇｅｎｅ；?ＰｇｌｇＣ，?ｎａｔｉｖｅ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｇｌｇＣ??轉(zhuǎn)化聚球藻ＰＣＣ７９４２后，涂布卡那霉素抗性平板獲得的轉(zhuǎn)化子的??ＰＣＲ鑒定結(jié)果如圖２．３所示，無(wú)插入片段的野生型條帶大小為２．２ｋｂ，包??含了插入片段的轉(zhuǎn)化子具有的條帶大小為４．２ｋｂ。并且，在轉(zhuǎn)化子條帶中??看不到野生型條帶，證明整合完全，說(shuō)明在聚球藻ＰＣＣ７９４２中成功于??ｇ／ｇＣ基因上游插入茶堿響應(yīng)核糖開關(guān)。我們將轉(zhuǎn)化藻株命名為聚球藻??ＳｙｗｅｃＺ／ｏｃｏｃｃｗｓ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１，下文簡(jiǎn)稱?ＸＣ１。??ＸＣ１?ＷＴ??５ｋ－？—＊??４ｋ－一??３ｋ－￣＊????ｍｍ??２?ｋ—??圖２．３工程藻株ＸＣｌ和對(duì)照藻株ＷＴ７９４２的基因型鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｇｅｎｏｔｙｐｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＣＣ７９４２－ＸＣ１?ａｎｄ?ＰＣＣ７９４２－ＷＴ?ｂｙ?ＰＣＲ．??２７??

驗(yàn)證在工程藻株ＸＣ１中茶堿響應(yīng)核糖開關(guān)的可行性，我們選擇蛋白免疫??印跡（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ）對(duì)轉(zhuǎn)化藻株進(jìn)行檢測(cè)。??藍(lán)細(xì)菌蛋白提取后的濃度測(cè)定所采用標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２．４所示，并根??據(jù)待測(cè)樣品的最低濃度，將所有樣品的蛋白濃度調(diào)整為一致，保證后續(xù)??蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)上樣時(shí)具有相同的蛋白總量。??蛋白免疫印跡結(jié)果如圖２．５所示：通過(guò)蛋白免疫印跡結(jié)果可以看出，??對(duì)照藻株ＷＴ７９４２的ＧｌｇＣ蛋白豐度在不同茶堿濃度下所產(chǎn)生的區(qū)別較??小，茶堿濃度的遞增對(duì)ＧｌｇＣ蛋白的表達(dá)量沒(méi)有太大影響。而茶堿響應(yīng)核??糖開關(guān)調(diào)控ｇ／ｇＣ基因的工程藻株ＸＣ１在不同茶堿濃度下的ＧｌｇＣ蛋白??表達(dá)量具有較大差異：在無(wú)茶堿誘導(dǎo)（ＴＯ）時(shí)，蛋白豐度上要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于??ＷＴ７９４２；隨著茶堿濃度增加至ｌｌＯｐＭ?（Ｔ１１０）時(shí)，ＧｌｇＣ蛋白豐度出現(xiàn)??了明顯的提高，在茶堿濃度提高為ｌｌＯＯｐＭ?（Ｔ１１００）時(shí)，ＧｌｇＣ蛋白豐度??則明顯高于ＷＴ７９４２。這說(shuō)明茶堿對(duì)于ＷＴ７９４２藻株的影響較小，同時(shí)??插入茶堿響應(yīng)核糖開關(guān)的工程藻株ＸＣ１通過(guò)外源茶堿濃度的改變成功??實(shí)現(xiàn)了在翻譯水平上對(duì)ＧｌｇＣ蛋白的誘導(dǎo)調(diào)控。??０．８????ｙ?＝?１．７４２９Ｘ?＋?０．０２９８??０７?－?ＲＪ?＝?０．９９２５??０．６?－??的?〇．５?－??ｑ＞?？？？？??０．

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Sucrose Secreted by the Engineered Cyanobacterium and Its Fermentability[J]. DUAN Yangkai,LUO Quan,LIANG Feiyan,LU Xuefeng.  Journal of Ocean University of China. 2016(05)



本文編號(hào)：3017340