乳酸菌應(yīng)用于食品發(fā)酵領(lǐng)域具有悠久歷史,它產(chǎn)生有機(jī)酸、維生素、多糖等高附加值化合物,賦予產(chǎn)品特殊的風(fēng)味、質(zhì)地和保質(zhì)期。最近發(fā)現(xiàn),一些乳酸菌也對人體有益生作用。干酪乳桿菌作為乳酸菌,是一種重要的工業(yè)微生物,廣泛應(yīng)用于乳制品發(fā)酵領(lǐng)域。目前,基因組測序技術(shù)及功能基因組學(xué)的發(fā)展為干酪乳桿菌中假想蛋白的功能鑒定,代謝工程改造,合成生物學(xué)的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。然而,干酪乳桿菌的基因組編輯主要采用同源雙交換的方法,這種方法效率低下,耗時(shí)且操作煩瑣,阻礙了上述課題的研究進(jìn)程。此外,干酪乳桿菌也可以作為理想的細(xì)胞工廠表達(dá)抗原,生物活性分子以及一些酶類。但是,干酪乳桿菌作為細(xì)胞工廠還存在很多亟需解決的問題,例如,無法實(shí)現(xiàn)高效地程序化精簡基因組,以便構(gòu)建最適細(xì)胞工廠;無法以染色體整合的形式表達(dá)足量的重組蛋白,解決以質(zhì)粒的方式表達(dá)重組蛋白遺傳穩(wěn)定性低的問題;無法高效篩選原噬菌體刪除株,避免原噬菌體在發(fā)酵過程中被各種脅迫誘導(dǎo)脫離染色體導(dǎo)致發(fā)酵流產(chǎn)。本文主要以干酪乳桿菌為宿主,圍繞建立基因組編輯工具以解決干酪乳桿菌在上述各個(gè)領(lǐng)域中遇到的問題展開研究。首先,生物信息學(xué)分析并體內(nèi)驗(yàn)證了原噬菌體重組酶LCABL_... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１?（Ａ）該圖顯示發(fā)表的與乳酸乳球菌相關(guān)文獻(xiàn)的增加趨勢

??圖１－２乳鏈菌肽控制表達(dá)（ＮＩＣＥ）系統(tǒng)原理圖（Ｍｉｅｒａｕ＆Ｋ丨ｅｅｒｅｂｅｚｅｎｉ，２００５）〇??Ｆｉｇ．?１－２?Ｎｉｓｉｎ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ?ｇｅｎｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?（ＮＩＣＥ）?ｓｙｓｔｅｍ．??與大腸桿菌中經(jīng)典的乳糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)類似，圍繞乳桿菌中乳糖操縱子啟動??子Ｐｉａｃ與合成型ＰｉａｃＳｙｎｔｈ啟動子的研宄也有報(bào)道（Ｈｅｉｓｓｅｔａｌ．，?２０１６）。其中，Ｌ．ｃａｓｅ／??ＢＬ２３中乳糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。Ｚ．ｏｗｄ?ＢＬ２３中乳糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)遵??循嚴(yán)格的葡萄糖抑制以及底物誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制，這是由于啟動子下游基因的轉(zhuǎn)錄受??到雙重調(diào)控：碳代謝抑制（ＣＣＲ）和ＬａｃＴ?（Ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）的轉(zhuǎn)錄抗終止作用??（圖１－３）。因此，在葡萄糖存在時(shí)，啟動子下游的基因幾乎不轉(zhuǎn)錄，可以應(yīng)用于??嚴(yán)謹(jǐn)型蛋白的表達(dá)（Ａｌｐｅｒｔ?＆?Ｓｉｅｂｅｒｓ，?１９９７，?Ｍｏｎｅｄｅｒｏ?ｅｔ?ａＬ，?１９９７，?Ｇｏｓａｌｂｅｓ?ｅｔ?ａｌ．，??１９９９）。這一系統(tǒng)的缺點(diǎn)是重組蛋白表達(dá)量比ＮＩＣＥ系統(tǒng)低且具有菌株特異性。??此外，Ｐｚｎ－ａＹＲ表達(dá)系統(tǒng)和增強(qiáng)型鋅誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)（Ｚｉｎｃ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??ｓｙｓｔｅｍ，?Ｚｉｒｅｘ）均可與ＮＩＣＥ系統(tǒng)在乳酸乳球菌中同時(shí)應(yīng)用，在無毒的Ｚｎ２＋水平下??實(shí)現(xiàn)蛋白的嚴(yán)謹(jǐn)型表達(dá)〇＾１１＆卩（＾１＾

傳統(tǒng)的乳酸菌靶向基因組修飾大多依賴整合質(zhì)粒與基因組之間的同源雙交??換。利用細(xì)胞自身的重組蛋白ＲｅｃＡ介導(dǎo)整合質(zhì)粒和基因組之間的同源區(qū)域發(fā)生??同源重組，實(shí)現(xiàn)目的基因的插入或敲除（圖１－４）。如果使用可以復(fù)制的載體作為??整合質(zhì)粒，需要有篩選方法來區(qū)分含有復(fù)制質(zhì)粒的細(xì)胞和質(zhì)粒整合到基因組中的??細(xì)胞，目前這樣的篩選方法還很少，因此，此方法沒有得到廣泛的應(yīng)用。為了避??免上述篩選步驟，研究者利用?ｐＯＲＩ（Ｌａｗ?ｅｔ?ａｌ．，?１９９５），?ｐＵＣ１８／１９（Ｇｒｏｏｔ?ｅｔ?ａｌ．，?２００５）??和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ?ＳＫ＿（Ｌｅｌｏｕｐ?ｅｔ?ａｌ．，１９９７）等在乳酸菌中不復(fù)制的質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)Ｌｃ．??基因的插入失活或外源基因的整合。但是，由于細(xì)胞自身的同源重組效率較低，??使用這種方法需要有足夠高的轉(zhuǎn)化效率才有可能篩選到發(fā)生突變的目標(biāo)菌株??（Ｍａｇｕｉｎ?ｅｔ?ａｌ．，?１９９２，?Ｆａｎｇ?＆?Ｏ＇Ｔｏｏｌｅ，?２００９）〇??另一種常用的解決方法是使用條件型復(fù)制質(zhì)粒，如溫度敏感型質(zhì)粒ｐＧ＋ｈｏｓｔ??系列質(zhì)粒（Ｍａｇｕｉｎ?ｅｔ?ａｌ．


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