羧肽酶B（carboxypeptidase B,CPB）是一類水解蛋白或多肽底物的金屬蛋白酶,它作為一種重要的工具酶被應(yīng)用于胰島素等產(chǎn)品的加工。近年來,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛、高密度發(fā)酵技術(shù)成熟、生產(chǎn)過程簡單、且利于規(guī)�；a(chǎn)。本研究試圖構(gòu)建重組人CPB酶原的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),同時,建立較系統(tǒng)而規(guī)�；陌l(fā)酵和純化生產(chǎn)工藝,以得到高純度、高活性的重組人CPB產(chǎn)品。本文將酶切得到的PCPB目的基因片段與pPIC9載體進(jìn)行連接,得到重組質(zhì)粒pPIC9-PCPB,再轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115,構(gòu)建重組人CPB酶原畢赤酵母表達(dá)菌株。將構(gòu)建得到的菌株經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接到BMGY搖瓶培養(yǎng)基中,在溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)200rpm條件下,每24h補加終體積1%的甲醇誘導(dǎo),誘導(dǎo)72h后,篩選出表達(dá)量最高的重組人CPB酶原畢赤酵母表達(dá)菌株。優(yōu)化得到重組人CPB酶原種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,甘油10g/L,磷酸二氫鉀1.2g/L,十二水磷酸氫二鈉2.2g/L,消泡劑25μl/L。在溫度30℃、轉(zhuǎn)數(shù)220rpm條件下培養(yǎng)24小時左右,重組人CPB酶原種子菌體OD600可以達(dá)到10～... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．２?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜??Ｍ：標(biāo)準(zhǔn)ＤＮＡ；?１，?２：經(jīng)Ｘｈｏｌ和Ｎｏｔｌ雙酶切后重組質(zhì)粒樣品??

切膠回收ＰＣＰＢ目的基因片段，與經(jīng)過同樣的酶雙酶切并切膠回收的??ｐＰＩＣ９載體大片段進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ＤＨ５ａ，重組質(zhì)粒命名為??ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ。ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖２．１所示。重組質(zhì)粒酶切電??泳結(jié)果見圖２．２。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒經(jīng)過Ｘｈｏｌ和Ｎｏｔｌ雙酶切后，可以得到１３００ｂｐ??左右的目的片段和８０００ｂｐ左右的載體片段，與理論值相符。重組質(zhì)粒測序結(jié)果??顯示，所測目的基因序列與基因合成理論序列相一致，表達(dá)載體構(gòu)建成功。??ｒ－－…－－????？＞（，１」＇？？一????ｐＰＩＣ９?ＰＣＰＢ??１?Ｘｌｄ＾ＮｏｌＩ?［￣］?Ｘｌｉｃｉ＾ＮｏＵ??＇?一??ｐＰＩＣ９?ＤＮＡ?ｈ｜ｐｉ＊ｃ?ｒｙ?ＰＣＰＢ??ｖ感＃??ＰＰ１Ｃ９－ＰＣＰＢ??圖２．１?ｐＰｌＣ９－ＰＣＰＢ重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程圖??Ｆｉｇ．２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ?ｐｌａｓｍｉｄ??ｆｃ＞ｐ?ＩＶＩ?１?２??８０００——Ｐ??５０００?——Ｈ??３０００??１??２０００——■??０．０００——■??圖２．２?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜??Ｍ：標(biāo)準(zhǔn)ＤＮＡ；?１，?２：經(jīng)Ｘｈｏｌ和Ｎｏｔｌ雙酶切后重組質(zhì)粒樣品??Ｆｉｇ．２．２?Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ??Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１，２：Ｄｉｇｅｓｔｅｄ?

１２?第２章重組人ＣＰＢ酶原酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建??２．４．２重組質(zhì)粒ＰＰＩＣ９－ＰＣＰＢ的導(dǎo)入??鑒定結(jié)果見圖２．３。結(jié)果顯示１４個重俎子（１號至１４號）與陽性對照組均能??夠擴(kuò)增出１４００ｂｐ左右目的基因片段，而陰性對照組（１５號）無法擴(kuò)增出目的基??因片段。說明重組質(zhì)粒ＰＰＩＣ９－ＰＣＰＢ已經(jīng)成功整合到了?ＧＳ１１５宿主基因組中。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?ａ?５?６?７?Ｓ?Ｂ?ｌＯ?１１?１２?１３?Ｘ４?１５?２６??５０００???３０００???２０００???１５００一??７５０—??ｎＨＨＨＨＨＨＩ??圖２．３?ｐＰＩＣ＾ＰＣｒｏ／ＧＳ?Ｕ?５的菌落ＰＣＲ鑒定圖譜??Ｍ：標(biāo)準(zhǔn)ＤＮＡ；?１？１４：】４個ＰＣＲ重組子樣品；］５：陰性對照；１６：陽性對照；??Ｆｉｇ．２．３?Ｃｏｌｏｎｙ?ＰＣＲ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ／ＧＳ?１１５??Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；ｌ￣１４：ＰＣＲ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?１４?ｓａｍｐｌｅｓ；?１５：Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ；??１６：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??２．４．３重組人ＣＰＢ酶原畢赤酵母表達(dá)菌株的篩選??電泳結(jié)果見圖２．４。結(jié)果顯示，８個樣品均有目的蛋白表達(dá)，其中７號表迗量??相對較高，因此將７號樣品活化后進(jìn)行菌種保藏，準(zhǔn)備進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。??ｋＥ＞ａ?Ｍｌ?２?３?４?５?６７?８??：：：＝?＿??ｉｓ．ａ＿＿感麻寒編??—Ｂ??圖２．４?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ／ＧＳ?１１


本文編號：2971677