靶向修飾H19/IGF2的CTCF結合位點DNA甲基化對小鼠胚胎干細胞及早期胚胎發(fā)育的影響
發(fā)布時間：2020-12-31 03:01
基因組印記（Genomic Imprinting）是控制印記基因（imprinted genes）表達的表觀遺傳調節(jié)機制,通過選擇性地沉默父本或母本來源的一個等位基因,參與調節(jié)哺乳動物生長和發(fā)育,并與家族遺傳病有關。人的印記基因H19和Igf2連鎖位于染色體11p15.5區(qū),由一套增強子調節(jié)基因表達,受H19/Igf2基因間的差異甲基化區(qū)域DMR（Differentially Methylated Region）控制,DMR區(qū)域的甲基化影響CTCF（CCCTC-binding factor）的結合控制H19和Igf2差異性表達,但目前對CTCF結合區(qū)域DNA甲基化的調節(jié)還有待認識。本研究利用CRISPR/dCas9介導的DNMT3A或TET特異修飾CTCF結合位點DNA甲基化狀態(tài),研究其對印記基因的表達、胚胎干細胞的細胞全能性和早期胚胎發(fā)育的影響。本研究首先利用CRISPR/dCas9技術,針對H19/Igf2的CTCF的四個結合位點,設計了8種gRNA,構建pgRNA-humanized-Igf2載體,同時與CRISPR/dCas9-Dnmt3a和CRISPR/dCas9-Tet載體...
【文章來源】：內蒙古大學內蒙古自治區(qū) 211工程院校
【文章頁數】：85 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
pgRNA-humanized載體酶切鑒定圖
圖 2.2 共轉染效率的檢測。A. 流式細胞儀檢測轉染效率； B. 轉染細胞后熒光強度檢測Fig. 2.2 Detection of co-transfection efficiency.A. the transfection efficiency of detected by cells flow cytometry; B. the fluorescence intensity after transfection.根據流式細胞儀以及顯微鏡的觀測下得出，在共轉染時，Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP與 pgRNA-humanized 各取 4μg 轉染細胞時，細胞的轉染效率最高�？梢赃_到 11.9%(圖 2.2A)。熒光顯微鏡下可以觀察的出，細胞在共轉之后，在質粒在轉染 48h 后在細胞內可以穩(wěn)定表達（圖 2.2 B）。3.1.3 載體的作用效果及篩選對構建的 8 種 pgRNA-humanized-Igf2 分別與 Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP 載體和Fuw-dCas9-Tet-P2A-tagBFP 載體共轉染細胞，經 qPCR 驗證，篩選對其 Igf2 表達改變最大過表達載體及沉默載體。在轉染 48h 時提取細胞 RNA，進行 qPCR 驗證。
35圖 2.5 CTCF 結合位點甲基化的檢測。. 在 MEFs 細胞中轉入 dCas9-Dnmt3a 和 dCas9-Tet 后，CTCF 結合位點的甲基化檢測； B. 在 MES 轉dCas9-Dnmt3a 后，CTCF 結合位點的甲基化檢測。Fig. 2.5 Detection of methylation of four CTCF sites at H19/Igf2.A. Detection of methylation of CTCF binding sites after transfer of dCas9-Dnmt3a and dCas9-Tet into MEFs
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Manifestations of type 2 diabetes in corneal endothelial cell density,corneal thickness and intraocular pressure[J]. Stella Briggs,Uchechukwu L Osuagwu,Essam M AlHarthi. The Journal of Biomedical Research. 2016(01)
本文編號：2948825
【文章來源】：內蒙古大學內蒙古自治區(qū) 211工程院校
【文章頁數】：85 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
pgRNA-humanized載體酶切鑒定圖
圖 2.2 共轉染效率的檢測。A. 流式細胞儀檢測轉染效率； B. 轉染細胞后熒光強度檢測Fig. 2.2 Detection of co-transfection efficiency.A. the transfection efficiency of detected by cells flow cytometry; B. the fluorescence intensity after transfection.根據流式細胞儀以及顯微鏡的觀測下得出，在共轉染時，Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP與 pgRNA-humanized 各取 4μg 轉染細胞時，細胞的轉染效率最高�？梢赃_到 11.9%(圖 2.2A)。熒光顯微鏡下可以觀察的出，細胞在共轉之后，在質粒在轉染 48h 后在細胞內可以穩(wěn)定表達（圖 2.2 B）。3.1.3 載體的作用效果及篩選對構建的 8 種 pgRNA-humanized-Igf2 分別與 Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP 載體和Fuw-dCas9-Tet-P2A-tagBFP 載體共轉染細胞，經 qPCR 驗證，篩選對其 Igf2 表達改變最大過表達載體及沉默載體。在轉染 48h 時提取細胞 RNA，進行 qPCR 驗證。
35圖 2.5 CTCF 結合位點甲基化的檢測。. 在 MEFs 細胞中轉入 dCas9-Dnmt3a 和 dCas9-Tet 后，CTCF 結合位點的甲基化檢測； B. 在 MES 轉dCas9-Dnmt3a 后，CTCF 結合位點的甲基化檢測。Fig. 2.5 Detection of methylation of four CTCF sites at H19/Igf2.A. Detection of methylation of CTCF binding sites after transfer of dCas9-Dnmt3a and dCas9-Tet into MEFs
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Manifestations of type 2 diabetes in corneal endothelial cell density,corneal thickness and intraocular pressure[J]. Stella Briggs,Uchechukwu L Osuagwu,Essam M AlHarthi. The Journal of Biomedical Research. 2016(01)
本文編號：2948825
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