基因組印記（Genomic Imprinting）是控制印記基因（imprinted genes）表達(dá)的表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制,通過選擇性地沉默父本或母本來源的一個(gè)等位基因,參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物生長和發(fā)育,并與家族遺傳病有關(guān)。人的印記基因H19和Igf2連鎖位于染色體11p15.5區(qū),由一套增強(qiáng)子調(diào)節(jié)基因表達(dá),受H19/Igf2基因間的差異甲基化區(qū)域DMR（Differentially Methylated Region）控制,DMR區(qū)域的甲基化影響CTCF（CCCTC-binding factor）的結(jié)合控制H19和Igf2差異性表達(dá),但目前對(duì)CTCF結(jié)合區(qū)域DNA甲基化的調(diào)節(jié)還有待認(rèn)識(shí)。本研究利用CRISPR/dCas9介導(dǎo)的DNMT3A或TET特異修飾CTCF結(jié)合位點(diǎn)DNA甲基化狀態(tài),研究其對(duì)印記基因的表達(dá)、胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞全能性和早期胚胎發(fā)育的影響。本研究首先利用CRISPR/dCas9技術(shù),針對(duì)H19/Igf2的CTCF的四個(gè)結(jié)合位點(diǎn),設(shè)計(jì)了8種gRNA,構(gòu)建pgRNA-humanized-Igf2載體,同時(shí)與CRISPR/dCas9-Dnmt3a和CRISPR/dCas9-Tet載體... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pgRNA-humanized載體酶切鑒定圖

圖 2.2 共轉(zhuǎn)染效率的檢測。A. 流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率； B. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光強(qiáng)度檢測Fig. 2.2 Detection of co-transfection efficiency.A. the transfection efficiency of detected by cells flow cytometry; B. the fluorescence intensity after transfection.根據(jù)流式細(xì)胞儀以及顯微鏡的觀測下得出，在共轉(zhuǎn)染時(shí)，F(xiàn)uw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP與 pgRNA-humanized 各取 4μg 轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高�？梢赃_(dá)到 11.9%(圖 2.2A)。熒光顯微鏡下可以觀察的出，細(xì)胞在共轉(zhuǎn)之后，在質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染 48h 后在細(xì)胞內(nèi)可以穩(wěn)定表達(dá)（圖 2.2 B）。3.1.3 載體的作用效果及篩選對(duì)構(gòu)建的 8 種 pgRNA-humanized-Igf2 分別與 Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP 載體和Fuw-dCas9-Tet-P2A-tagBFP 載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng) qPCR 驗(yàn)證，篩選對(duì)其 Igf2 表達(dá)改變最大過表達(dá)載體及沉默載體。在轉(zhuǎn)染 48h 時(shí)提取細(xì)胞 RNA，進(jìn)行 qPCR 驗(yàn)證。

35圖 2.5 CTCF 結(jié)合位點(diǎn)甲基化的檢測。. 在 MEFs 細(xì)胞中轉(zhuǎn)入 dCas9-Dnmt3a 和 dCas9-Tet 后，CTCF 結(jié)合位點(diǎn)的甲基化檢測； B. 在 MES 轉(zhuǎn)dCas9-Dnmt3a 后，CTCF 結(jié)合位點(diǎn)的甲基化檢測。Fig. 2.5 Detection of methylation of four CTCF sites at H19/Igf2.A. Detection of methylation of CTCF binding sites after transfer of dCas9-Dnmt3a and dCas9-Tet into MEFs

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Manifestations of type 2 diabetes in corneal endothelial cell density,corneal thickness and intraocular pressure[J]. Stella Briggs,Uchechukwu L Osuagwu,Essam M AlHarthi.  The Journal of Biomedical Research. 2016(01)



本文編號(hào)：2948825