谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）在微生物發(fā)酵工業(yè)上具有很大的應(yīng)用潛力,可以通過代謝工程來生產(chǎn)多種氨基酸,而基因組編輯技術(shù)在其代謝工程中發(fā)揮著重要的作用。在谷氨酸棒桿菌中,傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)都存在著重組效率低,耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn),難以滿足工業(yè)菌株改造的需求。此外,由于不同菌株之間的基因組差異,導(dǎo)致基因組編輯技術(shù)的適用性也存在一定的限制,例如SacB反向篩選系統(tǒng)并不適用于谷氨酸棒桿菌ATCC 14067,因此仍需進(jìn)一步來探究新的基因組編輯技術(shù)。基于此,本研究以谷氨酸棒桿菌ATCC 14067為研究對(duì)象,初步建立了基于CRISPR/Cpf1的基因組編輯系統(tǒng),并進(jìn)一步通過不同PAM和可編輯位點(diǎn)范圍的探究?jī)?yōu)化了該系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用,然后將其成功應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的多基因同時(shí)編輯和DNA大片段的刪除上。該技術(shù)有效完善了谷氨酸棒桿菌ATCC 14067的基因組修飾系統(tǒng),為其代謝途徑的改造奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:（1）谷氨酸棒桿菌ATCC 14067中基于CRISPR/Cpf1的基因組編輯技術(shù)的建立與優(yōu)化首先通過測(cè)試雙質(zhì)粒（pJYS1Pta... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

谷氨酸棒桿菌應(yīng)用于多種化合物的生產(chǎn)Fig.1-1Corynebacteriumglutamicumusedintheproductionofvariouscompounds

測(cè)性和調(diào)節(jié)性；阻斷一些非必需的代謝途徑可以有助于提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化靶向生物制品的率；強(qiáng)化一些必需的代謝途徑可以大大提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化靶向生物制品的效率。在早期的十幾年中，基于兩輪同源重組的 SacB 反向篩選系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于谷氨棒桿菌的基因組工程中，該系統(tǒng)利用果聚糖酶 SacB（SacB 能夠?qū)⒄崽欠纸鉃槠咸烟枪牵⒐蔷酆蠟楣厶�，�?duì)谷氨酸棒桿菌有致死性）作為反向篩選標(biāo)記，經(jīng)過輪單交換完成靶標(biāo)基因的編輯。但該系統(tǒng)是通過菌株自身的同源重組系統(tǒng)來完成兩次交換，重組效率較低，且陽性轉(zhuǎn)化子的概率＜50%[14-16]。此外，Cre/loxP 重組系統(tǒng)也泛應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌基因組上 DNA 片段的敲除和替換[17]。Cre/loxP 重組系統(tǒng)是由 C重組酶和其所識(shí)別的兩個(gè) loxP 位點(diǎn)共同組成，Cre 酶介導(dǎo)兩個(gè) loxP 位點(diǎn)完成分子內(nèi)組，使 loxP 位點(diǎn)間的序列被剪切，并留下 1 個(gè) loxP 位點(diǎn)。而對(duì)應(yīng)的 Cre/mutant lox 系是將 loxP 位點(diǎn)改造為突變的 lox71、lox66 序列，二者之間的序列被 Cre 酶切割后，留不被 Cre 酶識(shí)別的突變 lox72 序列，可用于基因片段的連續(xù)無痕敲除[18]。然而，該方也是費(fèi)力耗時(shí)的，仍需進(jìn)一步開發(fā)新的基因組編技術(shù)。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文RecFACS 方法中，異源基因整合到染色體中是基于多重自動(dòng)化基因組工程概念，其中使用由不同噬菌體編碼的同源重組蛋白將單鏈 DNA 直接引入細(xì)菌染色體中。突變體的篩選是通過快速自動(dòng)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）完成。然而，RecFACS 方法需要構(gòu)建靶基因特異性生物傳感器和 FACS 用于菌落篩選，妨礙其在系統(tǒng)基因組工程中的應(yīng)用[19]。此外，在我們之前的研究中，通過在谷氨酸棒桿菌 ATCC 14067 中優(yōu)化外源核酸外切酶-重組酶對(duì) RecET 協(xié)助外源線性 dsDNA 重組的條件，提高了 RecET 在谷氨酸棒桿菌中的重組效率；建立 RecET 介導(dǎo)的自我切割線性雙鏈 DNA 的重組系統(tǒng)（RecET-Cre/lox系統(tǒng)），實(shí)現(xiàn)了基因組上靶標(biāo)基因的連續(xù)無痕敲除，其基因敲除的效率高達(dá) 94%以上[20]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于CRISPR系統(tǒng)基因編輯與基因調(diào)控技術(shù)的發(fā)展[J]. 楊明輝,陶景麗,柴孟龍,吳昊,連正興,劉國(guó)世.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2018(02)
[2]新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1[J]. 楊帆,李寅.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(03)

博士論文
[1]谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067中L-精氨酸合成途徑的反饋抑制機(jī)制解析及其代謝工程改造[D]. 黃園園.華南理工大學(xué) 2018

碩士論文
[1]谷氨酸棒狀桿菌基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建[D]. 譚延振.江南大學(xué) 2012



本文編號(hào)：2925437