發(fā)布時(shí)間：2020-12-10 14:10

　　乳酸菌是一類與人的身體健康密切相連的微生物。隨著完成全基因組測(cè)序的乳酸菌種類越來(lái)越多,功能性基因的研究也越來(lái)越重要。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、操作容易、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)勢(shì),可以精確、高效地對(duì)基因組進(jìn)行敲除或者修飾,已經(jīng)在不同物種中迅速發(fā)展起來(lái)并得到廣泛應(yīng)用,但是在乳酸菌中的研究報(bào)道不多。葡糖胺-6-磷酸合成酶（Glucosamine-6-phosphate synthase,GlmS）是氨基已糖代謝途徑（HBP）的催化酶,終產(chǎn)物是N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc）和氨基葡萄糖（GlcN）。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明glmS1基因是植物乳桿菌WCFS1編碼GlmS的重要基因,glmS1基因缺陷菌在不添加氨基葡糖的培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)。本研究將選用glmS1基因作為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的目的基因,構(gòu)建并驗(yàn)證植物乳桿菌WCFS1基因編輯系統(tǒng),為進(jìn)一步開(kāi)展更多乳酸菌的功能基因的編輯奠定基礎(chǔ)。本研究首先分別成功構(gòu)建了含Cas9、recT基因的pMT019和含tracrRNA的ptracrRNA兩種質(zhì)粒。隨后通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,確定了含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PSPPQ的pMT0... 

【文章來(lái)源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：81 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２三種ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)的Ｃａｓ蛋白??－

般長(zhǎng)度為幾個(gè)堿基，與原間隔序列緊鄰。一般情況下ＰＡＭ序列為ＮＧＧ。在適應(yīng)階段，??細(xì)菌對(duì)首次入侵的外源ＤＮＡ進(jìn)行識(shí)別，尋找潛在ＰＡＭ序列以確定原間隔序列，其??次將其整合到ＣＲＩＳＰＲ的兩個(gè)相鄰的重復(fù)序列之間，形成間隔序列（圖１．３）。因此，??可以通過(guò)間隔序列的位置來(lái)判斷細(xì)菌整合外源基因的時(shí)間先后［７９】。值得注意的是，在??適應(yīng)階段Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２兩種核酸酶都是不可缺少的，有研宄表明，將細(xì)菌Ｃｏｓ７和??Ｃｍ２兩個(gè)基因中的任意一個(gè)敲除后細(xì)菌都無(wú)法獲得間隔序列＠］。??在表達(dá)階段，當(dāng)己被宿主獲得間隔序列的外源ＤＮＡ再次進(jìn)入宿主菌時(shí)，ＣＲＩＳＰＲ??的表達(dá)被誘導(dǎo)上調(diào)…１，從而激發(fā)宿主菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用［８２］，其中??間隔序列和重復(fù)序列被轉(zhuǎn)錄成前體ＲＮＡ?（Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），最后Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ被剪切加工??形成成熟的ｃｒＲＮＡ，成熟的ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ與Ｃａｓ９蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物［８３］??（圖?１．４）。??在干擾階段，表達(dá)階段形成的核糖核蛋白復(fù)合物識(shí)別外源ＤＮＡ并與之結(jié)合，對(duì)??外源ＤＮＡ的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割

ｍｍ?剪切??圖１．４ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的表達(dá)階段??Ｆｉｇｌ．４?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??第三階段：靶向干抗?〇??掃描耙點(diǎn)ｇ歹�。�?（?３?ｔｒａｃｒＲＮＡ??＾ｍｍ?Ｃａｓ９?１?［???ｒｎ＾ｍ???ｃｒＲＮＡ???－－■■■－■－?－???????雙鏈外源ＤＮＡ?ＰＡＭ?Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ??ｊ?靶點(diǎn)序列配對(duì)??ｔｒａｃｒＲＮＡ－－ｈ．??ｆ?＼?Ｃａｓ９???ｐａｍ／?、?＾??氺????ｙ＂?一＾?木??外源ＤＮＡ雙鏈被剪開(kāi)??ｃｒＲＮＡ??圖１．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的干擾階段??Ｆｉｇｌ．５?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??１．３．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)研究進(jìn)展??２０１２年，Ｊｉａｎｇ?Ｗ等人＿將ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)中ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ兩個(gè)非編??碼ＲＮＡ改造成一個(gè)ＲＮＡ，即單導(dǎo)向ＲＮＡ?（Ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，?ｓｇＲＮＡ），它能夠指導(dǎo)??Ｃａｓ９蛋白對(duì)特定的ＤＮＡ序列進(jìn)行靶向斷裂，為ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]糖尿病患者腸道菌群研究[J]. 張弘超,金英朝,李成鎮(zhèn),劉大偉.  糖尿病新世界. 2016(15)
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[3]乳酸菌基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 杜勝陽(yáng),王斌斌,馮佳,侯斌曉,喬建軍.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2016(01)
[4]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組DNA片段編輯中的應(yīng)用[J]. 李金環(huán),壽佳,吳強(qiáng).  遺傳. 2015(10)
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[6]嬰幼兒腸道微生物的定植特征[J]. 范文廣,王婷婷,霍貴成.  食品工業(yè)科技. 2014(06)
[7]靈芝lz-8基因乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)及免疫特性[J]. 曲寧寧,陳萍,孫鑫澤,張雪,劉瓊.  吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2013(04)
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[10]分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌分類鑒定的研究進(jìn)展[J]. 劉斌,黃少磊,劉彥民,龔虹.  中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志. 2012(07)

博士論文
[1]源于嗜熱鏈球菌的真核CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立、優(yōu)化及其應(yīng)用研究[D]. 徐坤.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[2]利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯[D]. 沈彬.南京大學(xué) 2014
[3]代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖及過(guò)程優(yōu)化與控制[D]. 陳欣.江南大學(xué) 2012

碩士論文
[1]山羊CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)優(yōu)化的研究[D]. 黃玉.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018
[2]寡核苷酸重組工程和CRISPR-Cas9聯(lián)合運(yùn)用于大腸桿菌基因組編輯[D]. 孫尖.南京師范大學(xué) 2018
[3]小球藻CRISPR/Cas9基因編輯流程的建立和優(yōu)化[D]. 潘文歡.華南理工大學(xué) 2016
[4]廣西巴馬長(zhǎng)壽地區(qū)不同年齡人群腸道菌群分析[D]. 郭飛翔.揚(yáng)州大學(xué) 2015
[5]大腸桿菌pheA和tyrA基因敲除菌的構(gòu)建[D]. 蔣婕.吉林大學(xué) 2013



本文編號(hào)：2908826