乳酸菌是一類與人的身體健康密切相連的微生物。隨著完成全基因組測序的乳酸菌種類越來越多,功能性基因的研究也越來越重要。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于實驗簡單、操作容易、節(jié)省時間等優(yōu)勢,可以精確、高效地對基因組進行敲除或者修飾,已經(jīng)在不同物種中迅速發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用,但是在乳酸菌中的研究報道不多。葡糖胺-6-磷酸合成酶（Glucosamine-6-phosphate synthase,GlmS）是氨基已糖代謝途徑（HBP）的催化酶,終產(chǎn)物是N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc）和氨基葡萄糖（GlcN）。本實驗室前期研究表明glmS1基因是植物乳桿菌WCFS1編碼GlmS的重要基因,glmS1基因缺陷菌在不添加氨基葡糖的培養(yǎng)基中無法生長。本研究將選用glmS1基因作為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的目的基因,構(gòu)建并驗證植物乳桿菌WCFS1基因編輯系統(tǒng),為進一步開展更多乳酸菌的功能基因的編輯奠定基礎(chǔ)。本研究首先分別成功構(gòu)建了含Cas9、recT基因的pMT019和含tracrRNA的ptracrRNA兩種質(zhì)粒。隨后通過對啟動子結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化,確定了含誘導(dǎo)型啟動子PSPPQ的pMT0... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２三種ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)的Ｃａｓ蛋白??－

般長度為幾個堿基，與原間隔序列緊鄰。一般情況下ＰＡＭ序列為ＮＧＧ。在適應(yīng)階段，??細菌對首次入侵的外源ＤＮＡ進行識別，尋找潛在ＰＡＭ序列以確定原間隔序列，其??次將其整合到ＣＲＩＳＰＲ的兩個相鄰的重復(fù)序列之間，形成間隔序列（圖１．３）。因此，??可以通過間隔序列的位置來判斷細菌整合外源基因的時間先后［７９】。值得注意的是，在??適應(yīng)階段Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２兩種核酸酶都是不可缺少的，有研宄表明，將細菌Ｃｏｓ７和??Ｃｍ２兩個基因中的任意一個敲除后細菌都無法獲得間隔序列＠］。??在表達階段，當己被宿主獲得間隔序列的外源ＤＮＡ再次進入宿主菌時，ＣＲＩＳＰＲ??的表達被誘導(dǎo)上調(diào)…１，從而激發(fā)宿主菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用［８２］，其中??間隔序列和重復(fù)序列被轉(zhuǎn)錄成前體ＲＮＡ?（Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），最后Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ被剪切加工??形成成熟的ｃｒＲＮＡ，成熟的ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ與Ｃａｓ９蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物［８３］??（圖?１．４）。??在干擾階段，表達階段形成的核糖核蛋白復(fù)合物識別外源ＤＮＡ并與之結(jié)合，對??外源ＤＮＡ的特定位點進行切割

ｍｍ?剪切??圖１．４ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的表達階段??Ｆｉｇｌ．４?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??第三階段：靶向干抗?〇??掃描耙點ｇ歹�。�?（?３?ｔｒａｃｒＲＮＡ??＾ｍｍ?Ｃａｓ９?１?［???ｒｎ＾ｍ???ｃｒＲＮＡ???－－■■■－■－?－???????雙鏈外源ＤＮＡ?ＰＡＭ?Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ??ｊ?靶點序列配對??ｔｒａｃｒＲＮＡ－－ｈ．??ｆ?＼?Ｃａｓ９???ｐａｍ／?、?＾??氺????ｙ＂?一＾?木??外源ＤＮＡ雙鏈被剪開??ｃｒＲＮＡ??圖１．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的干擾階段??Ｆｉｇｌ．５?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??１．３．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)研究進展??２０１２年，Ｊｉａｎｇ?Ｗ等人＿將ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)中ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ兩個非編??碼ＲＮＡ改造成一個ＲＮＡ，即單導(dǎo)向ＲＮＡ?（Ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，?ｓｇＲＮＡ），它能夠指導(dǎo)??Ｃａｓ９蛋白對特定的ＤＮＡ序列進行靶向斷裂，為ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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[2]利用CRISPR/Cas9進行基因編輯[D]. 沈彬.南京大學(xué) 2014
[3]代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖及過程優(yōu)化與控制[D]. 陳欣.江南大學(xué) 2012

碩士論文
[1]山羊CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)優(yōu)化的研究[D]. 黃玉.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018
[2]寡核苷酸重組工程和CRISPR-Cas9聯(lián)合運用于大腸桿菌基因組編輯[D]. 孫尖.南京師范大學(xué) 2018
[3]小球藻CRISPR/Cas9基因編輯流程的建立和優(yōu)化[D]. 潘文歡.華南理工大學(xué) 2016
[4]廣西巴馬長壽地區(qū)不同年齡人群腸道菌群分析[D]. 郭飛翔.揚州大學(xué) 2015
[5]大腸桿菌pheA和tyrA基因敲除菌的構(gòu)建[D]. 蔣婕.吉林大學(xué) 2013



本文編號：2908826