胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)是一種依賴于一定的體外條件,能夠穩(wěn)定的自我更新,并保持多能性的細胞類型,一般來源于植入前囊胚的內(nèi)細胞團(Inner Cell Mass,ICM)。眾所周知胚胎干細胞具有能夠無限期增殖的能力,并且可以分化為成體所有類型的細胞,這使得它們對藥物開發(fā)和再生醫(yī)學(xué)的研究具有特別重要的價值。不同狀態(tài)的胚胎干細胞具有不同的多能性特征:Na?ve多能性狀態(tài),具有全面的分化潛能和嵌合體貢獻能力,以小鼠胚胎干細胞為代表;Primed多能性狀態(tài),具有受限的分化能力和嵌合體貢獻能力,以人類或靈長類胚胎干細胞為代表。而在其他大動物例如豬等物種中,Na?ve多能性狀態(tài)的胚胎干細胞仍然未能成功獲得。第一株小鼠胚胎干細胞系在含有胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和飼養(yǎng)層細胞的條件下建立,還有一種方式是通過添加白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)來促進小鼠胚胎干細胞系的建立。然而,在以上條件下,只有129/SV品系的小鼠胚胎能夠有效的建立起胚胎干細胞系,而其他大多數(shù)品系的小鼠胚胎干細胞系的建立仍然存在困難。直到2008年,人們利用含有MEK和GSK3抑制劑的2i培養(yǎng)體系,從許多其他通常被認(rèn)為無法成功獲得干細胞系的小鼠品系中建立了胚胎干細胞系。同時,利用該體系也可成功從大鼠胚胎培養(yǎng)獲得大鼠胚胎干細胞系。此外,通過篩選能夠維持OCT4遠端增強子活性的因子,建立了含LIF、Activin A和5種不同激酶抑制劑的5i/L/A培養(yǎng)體系,該體系可支持人Na?ve胚胎干細胞的自我更新,并能夠?qū)rimed狀態(tài)的人胚胎干細胞轉(zhuǎn)化為Na?ve多能性狀態(tài)。然而,這些體系似乎對小鼠或人以外的其他物種的Na?ve多能性胚胎干細胞的建立沒有效果。2017年,通過化學(xué)篩選,建立了一種添加了human LIF、CHR99021、(S)-(+)-dimethindene maleate(DiM)和minocycline hydrochloride(MiH)的培養(yǎng)基,稱為LCDM,該條件下可同時從人和小鼠胚胎獲得具有參與胚胎和胚外組織嵌合體發(fā)育能力的多能性干細胞系,這些細胞被稱為擴展多能干(Extended Pluripotent Stem,EPS)細胞,此研究開辟了從不同哺乳動物建立具有嵌合體能力的多能干細胞的途徑。豬不僅是主要的肉食來源動物,而且在代謝、免疫和生理上與人類非常相似,是生物醫(yī)學(xué)研究理想的動物模型,此外由于其器官與人類器官大小相近,豬也是異種器官移植的潛在供體。因此,豬多能干細胞(porcine Pluripotent Stem Cells,pPSCs)的建立與培養(yǎng)已成為科學(xué)家們的研究熱點。然而,目前已發(fā)表的豬多能干細胞系都被證明是類胚胎干細胞系,這些細胞系大多表現(xiàn)出有限的多能性特征,無法形成畸胎瘤或生殖系嵌合體。因此,真正的豬多能干細胞系的建立與獲得是十分值得期待的。為了從豬胚胎中建立多能干細胞人們已經(jīng)做了許多努力。雖然尚未獲得真正的豬胚胎干細胞系,但已從各種不同來源的豬胚胎中建立獲得了許多假定的豬多能性干細胞系。然而,與小鼠胚胎干細胞相比,這其中大多數(shù)細胞系的多能性都差強人意,具體表現(xiàn)為這些豬多能干細胞注入裸鼠皮下無法畸胎瘤或者嵌合后不能參與到生殖系的發(fā)育中。先前的研究表明,不同來源的豬胚胎干細胞系表現(xiàn)出克隆形態(tài)扁平的特征,并且其體外和體內(nèi)的分化能力有限。它們在細胞多能性分類上屬于Primed狀態(tài),而非Na?ve狀態(tài)。據(jù)此,本研究采用豬體內(nèi)6.5天囊胚,利用LCDM體系,嘗試建立豬多能性干細胞,并通過小樣本高通量測序分析LCDM體系獲得的豬多能性細胞及小鼠、人EPS細胞中多能性基因表達模式和相關(guān)信號通路活性狀態(tài)。我們獲得的結(jié)果表明:(1)在不同體系下利用豬體內(nèi)胚胎建立的多能性干細胞系均取得較好的效果。其中KOFL培養(yǎng)體系下,在接種2枚豬體內(nèi)胚胎的情況下成功獲得了1株豬多能干細胞系PeNK6,獲得的細胞克隆形態(tài)與人胚胎干細胞相似,呈現(xiàn)出一種扁平的單層細胞的狀態(tài),堿性磷酸酶(AP)檢測的結(jié)果表明該細胞系呈陽性的結(jié)果,即該細胞系具有多能性細胞的基本特征,免疫熒光檢測表達核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4,SOX2,NANOG,定量PCR檢測核心轉(zhuǎn)錄因子的表達結(jié)果與免疫熒光結(jié)果相一致。(2)在LCDM培養(yǎng)體系下,采用MEF或STO作為飼養(yǎng)層,對豬多能性干細胞建系效率不存在明顯的差別。獲得豬多能干細胞系,克隆形態(tài)呈扁平狀,但更加緊密,呈AP陽性,表達核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4,SOX2,NANOG,同時細胞還表達SSEA3和SSEA4。具有體外分化的能力。(3)獲得的細胞系進行了小樣本高通量測序分析,對小鼠,人和豬三個物種獲得的EPS/PSC中Na?ve和Primed相關(guān)基因的表達進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)小鼠,人和豬中LCDM體系下建立的EPS細胞或PSCs并不同于ESCs細胞或ICM細胞的多能性特征,雖然都會有核心轉(zhuǎn)錄因子的表達,但部分Na?ve和Primed相關(guān)基因的表達還是會存在差異。此外,對多能性信號通路激活情況也進行了比較分析,結(jié)果顯示在LCDM培養(yǎng)體系中豬多能性干細胞中TGFβ信號通路處于高活性狀態(tài),這可能是影響該體系下獲得豬多能性干細胞系多能性的原因之一。據(jù)此,我們在LCDM培養(yǎng)基中添加TGFβ信號通路抑制劑SB431542。結(jié)果顯示,與pPSC-LCDM細胞系相比優(yōu)化體系培養(yǎng)的細胞不僅核心轉(zhuǎn)錄因子的表達有所提高,細胞的增殖能力也顯著性增強。進一步,通過小樣本高通量測序,我們建立了ICM向pPSC-LCDMs轉(zhuǎn)變過程中的基因表達圖譜。結(jié)果顯示ICMs,BOs(blastocyst outgrowths)和PSCs的轉(zhuǎn)錄組具有較大差異,在胚胎接種后第1天,轉(zhuǎn)錄組即發(fā)生較大變化。結(jié)果顯示ICMs,BOs和PSCs的轉(zhuǎn)錄組具有較大差異,且BO5是獲得多能性干細胞過程中多能性變化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點。通過以上的結(jié)果,我們獲得以下結(jié)論:(1)在LCDM體系下,利用豬體內(nèi)胚胎建立豬多能性干細胞系的效率較高,建系效率可達50%左右,而且使用MEF或STO對建系效率沒有顯著影響。(2)LCDM培養(yǎng)體系可獲得具有一定多能性的豬胚胎干細胞系。(3)在LCDM體系下抑制TGFβ信號通路可有效提高豬多能性細胞系核心轉(zhuǎn)錄因子的表達,并促進細胞增殖。(4)基因表達圖譜分析表明,ICM向豬多能性細胞轉(zhuǎn)變過程中的ICMs、BOs和PSCs轉(zhuǎn)錄組具有較大差異。并且在ICM到pPSCs過程中,涉及到的MAPK,JAK/STAT,TGFβ以及WNT等信號通路可能是影響豬胚胎干細胞系建立及多能性的關(guān)鍵信號通路。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q813
【部分圖文】：

圖 1-1 干細胞的起源與分類[8]Fig. 1-1 Origin and Classification of Stem Cells[8]是重要的家畜動物，也是人類疾病模型和異種移植供體的最佳候選者之一，因小、形態(tài)和生理學(xué)上與人類有著眾所周知的相似性。豬多能干細胞的建立有助學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是對人類干細胞相關(guān)療法的有效性和安全性的評價幾十年來在小鼠和人的多能干細胞方面的研究取得了很大的進展，但是豬和其多能干細胞的研究卻遇到了巨大的困難，而且目前沒有獲得任何能夠滿足小鼠

圖 1-2 PS 細胞效力測定[12]Fig. 1-2 Assays for assessing PS-cell potency[12]干細胞研究的進展1 進展概述鼠胚胎干細胞目前被認(rèn)為是研究最為透徹和廣泛的干細胞。早在 1981 年，人們鼠囊胚中的內(nèi)細胞團進行培養(yǎng)，從而獲得了能夠在體外維持穩(wěn)定生長是細胞—[1, 9]。為了維持胚胎干細胞的特征，即在體外能夠無限增殖并能夠一直維持未培養(yǎng)過程中有兩種不同的操作，一是可以用飼養(yǎng)層細胞來接種小鼠的胚胎及培胚胎干細胞，或是使用條件培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，條件培養(yǎng)基來源于培養(yǎng)過小鼠培養(yǎng)液。相似的是，這兩種操作中都需要在培養(yǎng)液中添加血清成分，雖然血清產(chǎn)物其化學(xué)成分并不明確，但血清的存在對小鼠胚胎干細胞的生長及維持極為驗室所得到的細胞均可在體外無限增值，并保持分化為成體體內(nèi)幾乎所有類型1995 年，非人靈長類的胚胎干細胞從接種后內(nèi)細胞團樣的細胞形成上皮樣細胞

8圖 1-3 多能性的動態(tài)異質(zhì)性和階段性進展模型[92]Fig. 1-3 Dynamic heterogeneity and phased progression models of pluripotency[9多能性涉及的信號通路/STAT3 和 BMP 是小鼠胚胎干細胞的自我更新和多能性主要依賴的信號通路細胞中情況不盡相同，主要參與多能性維持的信號通路涉及到 bFGF 和 Ac8-100]。有趣的是，來源于小鼠上胚層的多能性干細胞為了維持其多能性以及需要激活的信號通路卻是與人胚胎干細胞相同[26, 101, 102]。除了依賴于相同類不同物種來源的多能性細胞還具有其他類似的特征相似的特征，如克隆
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本文編號：2877253