東方蠑螈IL-8在肢體再生過(guò)程中的表達(dá)變化

發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 20:52

　　研究背景:外傷后的肢體再生一直是醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)和研究熱點(diǎn),免疫系統(tǒng)及其調(diào)控機(jī)制被認(rèn)為在傷口愈合及再生完成的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。有尾兩棲類動(dòng)物蠑螈,具有獨(dú)特而強(qiáng)大的再生能力,是研究肢體再生過(guò)程中的理想模型。巨噬細(xì)胞對(duì)肢體早期再生過(guò)程至關(guān)重要,但是對(duì)啟動(dòng)巨噬細(xì)胞募集至損傷部位的信號(hào),目前還不清楚。白介素8(IL-8)是一種對(duì)巨噬細(xì)胞有強(qiáng)烈趨化作用的細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用,IL-8也參與細(xì)胞的遷移、血管生成、有絲分裂等生命活動(dòng)。但是IL-8在傷口愈合和再生中的作用及其機(jī)制的相關(guān)研究卻很少。方法及結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)首先建立東方蠑螈斷肢再生模型,根據(jù)蠑螈轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)合成引物,利用PCR技術(shù)首次克隆出蠑螈IL-8基因開(kāi)放閱讀框(ORF)共306bp,可編碼101個(gè)氨基酸。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a/IL-8,成功誘導(dǎo)表達(dá)IL-8融合蛋白,其大小約為29kD。隨后將鎳柱純化得到的融合蛋白作為抗原,制備蠑螈IL-8多克隆抗體,并利用ELISA、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、Western Blot等技術(shù)檢測(cè)抗體特異性。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR),切片原位雜交技術(shù)觀察蠑螈肢體再生不同時(shí)間點(diǎn)IL-8在核酸水平的表達(dá)變化和分布,發(fā)現(xiàn)IL-8 mRNA在肢體再生早期有明顯的上調(diào),隨著傷口愈合IL-8表達(dá)量逐漸下調(diào),直到肢體再生14dpa(day post amputation)恢復(fù)到正常水平,IL-8 mRNA表達(dá)主要集中分布在肢體截肢部位處。隨后利用IL-8多克隆抗體,觀察肢體再生不同時(shí)間點(diǎn)IL-8在蛋白水平的表達(dá)變化及分布,通過(guò)Western Blot結(jié)果顯示在蠑螈斷肢后,IL-8蛋白表達(dá)量持續(xù)升高,在再生3dpa時(shí)達(dá)到峰值,直至再生14dpa左右IL-8蛋白的表達(dá)逐漸恢復(fù)到正常基線水平,利用熒光免疫組織染色技術(shù)在肢體再生早期傷口處檢測(cè)到大量IL-8陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)論:本研究證實(shí)IL-8表達(dá)在蠑螈肢體再生的早期顯著上調(diào),推測(cè)IL-8可能參與肢體再生早期過(guò)程。這為進(jìn)一步揭示IL-8基因在肢體再生過(guò)程中的功能,解釋其相關(guān)作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q75;Q78
【部分圖文】：

蠑螈,斷肢,再生模型,肢體

菌；（4） 100mg/mL 氨芐青霉素：以 1:10 的比例溶解到 ddH2O 中，之后用 0.22μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，分裝到 1.5mL 的無(wú)菌離心管中備用。2.6 試驗(yàn)方法2.6.1 斷肢模型建立將體長(zhǎng)在 6-8mm 的健康蠑螈置于 0.1％三卡因溶液中 7-10 分鐘麻醉蠑螈，使用滅菌剪刀于蠑螈體側(cè)右上方肢體的肘關(guān)節(jié)上方 1mm 處截?cái)啵ㄒ?jiàn)圖 1），用鑷子向后推動(dòng)附著在骨骼上的肌肉組織，用 12 厘米彈簧剪修剪突出的肌肉組織，并確保表面截肢的是扁平的（任何突出的骨頭都會(huì)妨礙傷口愈合過(guò)程并延遲再生，這也可能導(dǎo)致肢體再生過(guò)程中傷口上皮破裂和真菌感染）。將蠑螈轉(zhuǎn)移至清水中，在 25℃下飼養(yǎng)，每 24 小時(shí)后更換清水。隨后分別在再生 0dpa、3dpa、7dpa、14dpa、30dpa、42dpa 對(duì)斷肢進(jìn)行樣本采集，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少取 5 個(gè)樣本。

電泳圖,電泳,產(chǎn)物,蠑螈

.2 PCR 獲取目的基因 IL-8本實(shí)驗(yàn)通過(guò) IL-8 基因引物設(shè)計(jì)，利用提取的再生過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄得到蠑螈肢體的 cDNA，利用 PCR 進(jìn)行蠑螈 IL-8 基因序列擴(kuò)增糖凝膠電泳檢測(cè)（見(jiàn)圖 2），發(fā)現(xiàn)其在目的片段大小處有一段很清晰單 306bp，電泳結(jié)果如下圖所示。時(shí)間（dpa） OD260/OD280 濃度（μg/μL0 1.840 0.4403 1.880 0.5207 1.956 0.29914 1.953 0.32730 1.946 0.11442 1.890 0.138

產(chǎn)物純化,蠑螈