發(fā)布時間：2020-11-01 15:12

　　 肝臟是脊椎動物特有的器官,在糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝、毒物代謝中發(fā)揮著重要作用。肝臟的發(fā)育在時空上受到嚴(yán)格的調(diào)控,近年來肝臟發(fā)育的研究使人們對于肝細(xì)胞命運(yùn)決定和肝細(xì)胞分化的分子機(jī)制有了更深入的了解,為肝病的治療提供了重要的理論依據(jù)。斑馬魚具有體外發(fā)育、胚胎透明、胚胎量大以及發(fā)育時間短的優(yōu)勢,已經(jīng)成為研究胚胎早期發(fā)育的理想模式動物,而且調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)制在人類和斑馬魚之間是保守的。斑馬魚肝臟的發(fā)育可以大致分為特化(Specification)、出芽(Budding)、生長(Outgrowth)等時期,雖然很多研究揭示了調(diào)控肝臟特化以及出芽的分子機(jī)制,但肝臟生長和分化過程中分子機(jī)制的研究是不完善的。斑馬魚gspt1l(G1 to S Phase Transition 1,like)是人類GSPT1/eRF3α(真核肽鏈釋放因子GTP結(jié)合亞基3α,Eukaryotic Peptide Chain Release Factor GTP-binding subunit 3α)的同源基因,屬于小GTPase家族。GSPT1通過結(jié)合GTP激活真核翻譯終止因子1(Eukaryotic Translation Termination Factor 1,eRF1)促進(jìn)肽鏈翻譯的終止。有研究表明GSPT1還通過參與14-3-3蛋白和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(Apoptosis Signal Regulating Kinase 1,ASK1)復(fù)合體的解聚誘發(fā)細(xì)胞凋亡。GSPT1缺失導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期(Gap 1 phase)停滯,細(xì)胞質(zhì)中未結(jié)合mRNA的核糖體亞基增多。在斑馬魚中g(shù)spt1l突變會導(dǎo)致胚胎致死,并在發(fā)育過程中出現(xiàn)血管增生。正向遺傳學(xué)篩選是一種發(fā)現(xiàn)新穎基因的重要手段,在之前的研究中我們利用ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)隨機(jī)誘變后篩選得到了一系列的肝臟發(fā)育缺陷型家系。其中v28突變體中肝臟以及外分泌胰腺、腸道祖細(xì)胞特化和出芽正常但生長被抑制,而且v28突變體中肝臟分化基因lfabp、gc的表達(dá)延遲,表明肝細(xì)胞分化被抑制。通過圖位克隆我們發(fā)現(xiàn)在v28突變體中g(shù)spt1l基因發(fā)生了無義突變。并且注射gspt1l野生型的mRNA可以部分挽救v28突變體的肝臟表型,說明gspt1l是v28的突變基因。gspt1l在肝臟、外分泌胰腺、腸道中有表達(dá),這也和v28突變體中消化器官缺陷的表型是相吻合的。為了研究gspt1l在消化器官發(fā)育中的作用首先我們通過細(xì)胞增殖和凋亡實驗證明了gspt11~(v28)突變通過降低細(xì)胞增殖速度影響了肝臟的生長。有文獻(xiàn)報道斑馬魚gspt1l突變可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白應(yīng)答(Unfolded Protein Response,UPR)進(jìn)而使腦血管發(fā)育畸形。UPR主要通過ATF6(Activating Transcription Factor 6)、PERK(Double-Stranded RNA-activated Protein Kinase(PKR)–like ER Kinase)、IRE1(Inositol Requiring Enzyme 1)三條通路調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力(ER stress)條件下細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng),在ER stress前期階段UPR主要促進(jìn)細(xì)胞生存,當(dāng)ER stress持續(xù)損害細(xì)胞時UPR轉(zhuǎn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在體外研究中人們發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)細(xì)胞生存的ATF6、IRE1通路活性在ER stress第二階段會逐漸衰減,而我們發(fā)現(xiàn)在gspt11~(v28)突變體中IRE1通路活性不會發(fā)生衰減。而且ER stress的抑制劑TUDCA(Sodium Tauroursodeoxycholate)可以降低gspt11~(v28)突變體中IRE1通路的活性并部分挽救肝細(xì)胞分化延遲的表型,但對肝臟及其他消化器官的增殖缺陷沒有作用。為了進(jìn)一步證明是否IRE1通路的活性是影響肝細(xì)胞分化的原因,我們進(jìn)一步使用Ire1α的特異性抑制劑STF-083010,但我們發(fā)現(xiàn)STF-083010不能挽救肝細(xì)胞分化延遲的表型。以上結(jié)果表明gspt1l對于斑馬魚肝臟及其他消化器官的發(fā)育是必須的,gspt11~(v28)突變通過UPR抑制肝臟的分化,而且可能是不依賴Ire1αRNase活性的。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q418
【部分圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文成肝臟原基（Liver Primordium），出芽完成后肝母細(xì)胞將恢復(fù)上皮細(xì)胞的形態(tài)(Lemaigre, 2009)。隨著側(cè)板中胚層（Lateral Plate Mesoderm, LPM）的不對稱遷移(Horne-Badovinac et al., 2003)，出芽后的肝臟原基將會向左生長，肝臟出芽的過程在大約34hpf結(jié)束，此時可以在肝臟原基和鄰近的食管的連接處看到明顯的溝壑。溝壑附近的部分肝細(xì)胞具有發(fā)育成膽管祖細(xì)胞的潛能，隨著溝壑的延伸，膽管將逐漸成型以連接肝臟原基和原始消化管(TaoandPeng,2009)。完成出芽后肝臟將進(jìn)入生長時期，并伴隨著肝實質(zhì)細(xì)胞（Hepatocyte）的分化，膽管網(wǎng)絡(luò)（BiliaryDuctalNetwork）的形成。當(dāng)斑馬魚發(fā)育到 96h 時，肝臟發(fā)育成兩葉，包含一個較大的左葉和一個較小的右葉，整體呈回旋鏢狀(Chu and Sadler, 2009)，并可以發(fā)揮它的大部分功能。而且有趣的是，和小鼠不同，斑馬魚肝臟的生長是不依賴于血管發(fā)生的(Korzh et al., 2008)。

圖 2 斑馬魚胰腺發(fā)育示意圖。在（A）5hpf 時期，紫色區(qū)域為內(nèi)胚層祖細(xì)胞。（B）原腸胚后期，胰腺祖細(xì)胞在 RA 信號的作用下開始出現(xiàn)。（C）大約 10 體節(jié)時期在內(nèi)胚層中線的位置開始特異性表達(dá) pdx1，（D）在15hpf 時期內(nèi)分泌胰腺祖細(xì)胞開始表達(dá) insulin。（E）24hpf 時期 insulin 陽性細(xì)胞出芽。（F）32hpf 時期 ptf1a陽性外分泌胰腺出芽。（G）48hpf 時期內(nèi)分泌胰腺和外分泌胰腺完成融合。（H）72hpf 時期外分泌胰腺中已經(jīng)有表達(dá) trypsin。(Tehrani and Lin, 2011)1.3.2 斑馬魚胰腺發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制在原腸作用完成之后，棒狀內(nèi)胚層沿著前后軸發(fā)生區(qū)域化，區(qū)域化決定了特化為胰腺的內(nèi)胚層細(xì)胞的位置，內(nèi)胚層前后軸區(qū)域化的分子機(jī)制涉及很多信號通路，其中主要包括來自中胚層的 RA（RetinoicAcid）、Fgfs、Wnt、Bmps 和 Hedgehog（Hh）信號通路。RA 是維生素 A 的衍生物，通過受體 RARs（RA Receptors）參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明 RA 的梯度擴(kuò)散調(diào)控多種祖細(xì)胞的分化模式(Rhinn and Dolle, 2012)。維生素 A 合成 RA 需要醛脫氫酶（Aldehyde Dehydrogenase, Aldh）的參與，研究表明 aldh2 缺陷或者使用 RARs 的抑制劑導(dǎo)致早期胚胎內(nèi)分泌胰腺和外分泌胰腺以及肝臟的缺失，但是不影響其他內(nèi)胚層器官的特化，進(jìn)一步研究表明 RA 誘導(dǎo)內(nèi)

圖 3UPR 概況圖。（A）適應(yīng)階段 UPR：在 UPR 未激活時，BIP 結(jié)合在 ATF6 、PERK、IRE1 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域使它們處于非激活狀態(tài)，未折疊或當(dāng)錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的累積導(dǎo)致 BIP 脫離并激活三條通路，當(dāng)BIP 脫離時，ATF6 會轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體通過 S1P 和 S2P 加工成為具有轉(zhuǎn)錄因子活性的 ATF6 ，PERK 和 IRE1會分別二聚體化及自磷酸化�；罨� PERK 會磷酸化 eRF2 從而降低總的蛋白翻譯并通過 ATF4 激活促進(jìn)細(xì)胞生存的基因，而活化的 IRE1 則通過 XBP1s 及 RIDD 促進(jìn)細(xì)胞生存。（B）適應(yīng)不良階段：當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力無法清除時，PERK 的下游基因 CHOP 將會上調(diào) ROS 并誘發(fā)凋亡，但 IRE1 誘導(dǎo)的 JNK 和 RIDD 在凋亡中扮演的角色目前還不清楚。良階段（maladaptive stage）。在適應(yīng)階段，UPR 主要通過增加分子伴侶的表達(dá)提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力，重建蛋白折疊穩(wěn)態(tài)，同時總的蛋白翻譯速率下降，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白輸入量。當(dāng) UPR 適應(yīng)期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白沒有有效清除時，細(xì)胞將進(jìn)入適應(yīng)不良階段，在這一階段細(xì)胞內(nèi)的翻譯抑制被解除，生存促進(jìn)因子的活性下降引起細(xì)胞凋亡(HetzandPapa,2018)。很多研究表明 UPR 中的三條支路不會立刻被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力全部激活，ATF6 和 IRE1 通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力條件下首先被激活，而且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的持續(xù)存在的條件下 ATF6 和 IRE1 通路的強(qiáng)度會逐漸衰減。PERK 通路會在 ATF6 和 IRE1 通路后啟動，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的持續(xù)存在的條件下始終保持激活狀態(tài)(Rutkowski et al., 2006)。
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