我國(guó)海藻養(yǎng)殖面積廣闊,褐藻資源尤其豐富,褐藻膠的年產(chǎn)量一直居于世界首位。褐藻膠分子量大,聚合度高,粘度大,吸收利用度差等特性,限制了其應(yīng)用范圍。因褐藻膠降解產(chǎn)物褐藻寡糖在醫(yī)藥方面具有降血壓、降血糖、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性,其開(kāi)發(fā)利用受到了各國(guó)研究學(xué)者越來(lái)越多的關(guān)注�；诠烟堑亩喙δ苄�,海帶多糖的降解及其海帶多糖降解菌株或降解酶的篩選是至關(guān)重要的。本文首先對(duì)高效海帶降解菌群的微生物多樣性及其褐藻多糖降解酶系進(jìn)行研究,并篩選獲得一株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株Vibrio sp.B4,對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究,進(jìn)一步利用其降解褐藻酸鈉制備褐藻寡糖,對(duì)其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析,為海洋寡糖類創(chuàng)新藥物的研究與開(kāi)發(fā)提供前期資料。本文利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)一組高效海帶降解菌群進(jìn)行宏基因組學(xué)分析,研究其微生物多樣性及褐藻多糖降解酶系。結(jié)果表明,測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后共獲得36552330條reads,預(yù)測(cè)得到105145條基因序列,比對(duì)顯示此高效海帶降解菌群中有75.41%的厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌,優(yōu)勢(shì)菌屬包括Lachnoclostridium、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)。數(shù)據(jù)顯示有4526個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)具有海帶多糖降解相關(guān)酶活性,其中糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)基因數(shù)量占比最大(1520),碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate binding module,CBM)(764)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase,CE)基因(706)和糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferase,GT)(693)比重次之,多糖裂合酶(polysaccharide lyase,PL)基因(107)和輔助氧化還原酶基因(auxiliary activity,AA)(126)數(shù)量較少。在不同的GH基因家族,歸屬于GH109、GH13、GH18和GH43家族的基因較多。此外還發(fā)現(xiàn)了少量的纖維小體組分蛋白基因。宏基因組學(xué)解析發(fā)現(xiàn)海帶降解菌群中有豐富的褐藻膠裂解酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶酶系產(chǎn)酶菌,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)人工高效褐藻降解菌群及褐藻多糖降解酶提供參考。本文為探索開(kāi)發(fā)高效褐藻膠裂解酶,以褐藻酸鈉為唯一碳源篩選培養(yǎng)基,從海帶降解菌群、海螺、鮑魚內(nèi)臟中共篩選出褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶菌株7株;其中鮑魚內(nèi)臟來(lái)源的弧菌屬細(xì)菌Vibrio sp.B4酶活較高,且利用電鏡觀察結(jié)果為非典型弧菌。Vibrio sp.B4在篩選平板上呈乳黃色,圓形微凸,不透明,表面濕潤(rùn)光滑,邊緣整齊,革蘭氏染色陰性,近球狀或橢圓狀,有鞭毛。對(duì)Vibrio sp.B4產(chǎn)褐藻膠裂解酶的發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化,獲得發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為褐藻酸鈉10 g/L,最適氮源為硫酸銨10 g/L,最適發(fā)酵條件為溫度30℃,接種量1%,培養(yǎng)基初始pH 6.0。同時(shí)對(duì)酶活曲線進(jìn)行測(cè)定,菌株在12 h后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期,酶活力達(dá)到最高值。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Plackett-Burman(PB)篩選出3個(gè)影響產(chǎn)酶活力的顯著因素:硫酸銨濃度、pH、接種量。通過(guò)響應(yīng)面進(jìn)一步分析優(yōu)化,得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為褐藻酸鈉10 g/L,硫酸銨10.91 g/L,NaCl 10 g/L,KH_2PO_4 1.0 g/L,MgSO_4?7H_2O 0.5 g/L,CaCl_2 0.2 g/L,FeSO_4?7H_2O 0.02 g/L,最佳發(fā)酵條件為溫度30℃,接種量1.1%,起始pH 6.07,轉(zhuǎn)速150 rpm。在最佳培養(yǎng)條件下,褐藻膠裂解酶活力可達(dá)19.09 U/mL,比基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下提高了3.67倍。該菌經(jīng)過(guò)產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化,酶活力得到較大幅度的提高,且其發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間短,可為褐藻膠裂解酶的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供參考。將Vibrio sp.B4生產(chǎn)的褐藻膠裂解酶命名為AL-B4,使用陰離子交換色譜、凝膠排阻色譜等方法對(duì)其進(jìn)行分離純化,采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)獲得純酶的單一條帶;然后對(duì)酶AL-B4的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步分析,結(jié)果顯示酶AL-B4的最適作用溫度40℃,最適作用pH為8.0,酶在pH 6.0-8.0范圍內(nèi)以及35℃以下穩(wěn)定;金屬離子Al~(3+)、Zn~(2+)及SDS、EDTA對(duì)酶活有較強(qiáng)抑制作用,Cu~(2+)離子使酶AL-B4幾乎無(wú)活性;Na~+、Co~(2+)、Fe~(3+)對(duì)酶活有促進(jìn)作用,且Mn~(2+)對(duì)酶AL-B4有較強(qiáng)促進(jìn)作用,而K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)對(duì)酶活沒(méi)有太大影響;氯化鈉可以大幅度提高該酶的活性,在氯化鈉濃度為0.75 mol/L-1.5 mol/L時(shí)酶活最大;在底物特異性研究中,該褐藻膠裂解酶可以同時(shí)降解甘露糖醛酸和古羅糖醛酸。利用獲得的酶AL-B4酶解褐藻酸鈉溶液,以超濾除去大分子蛋白等雜質(zhì)后,冷凍干燥得到褐藻寡糖,將褐藻寡糖進(jìn)行TLC、HPLC、LC-MS分析。TLC鑒定酶解獲得的褐藻寡糖主要是六個(gè)組分,進(jìn)一步經(jīng)HPLC、LC-MS分析,結(jié)果為單糖至六糖。通過(guò)對(duì)降解產(chǎn)物的研究,為褐藻膠裂解酶的商業(yè)化應(yīng)用提供了重要的研究基礎(chǔ),也為褐藻寡糖的酶法制備提供了良好的酶源。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.3;Q93
【部分圖文】：

基因組測(cè)序結(jié)果分析序列與 Non-Redundant（NR）數(shù)據(jù)R 軟件，將非冗余基因序列與數(shù)據(jù)，對(duì)未知序列進(jìn)行注釋，獲得碳水基因組 DNA 的提取NA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，提顯主帶，結(jié)果如圖 1.1 所示。這說(shuō)

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文idium 和芽孢桿菌屬數(shù)量最多，所占比例分別為 37.59%和硫胺素芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬只占總細(xì)菌的 7.97%、7解菌群進(jìn)一步比對(duì)，同源種分布結(jié)果如圖 1.3 所示。moamylovorans；短芽孢桿菌屬主要有 Brevibacillus pana agri BAB-2500 ， Brevibacillus reuszeri ；解硫胺素芽llus migulanus ；類芽孢桿菌屬主要有 Paenibacillus g sp.HGF5 ， Paenibacillus senegalensis ， Paenibacillusidium。

s thermoamylovorans；短芽孢桿菌屬主要有 Brevibacillus panacihumcillus agri BAB-2500 ， Brevibacillus reuszeri ；解硫胺素芽孢桿ibacillus migulanus ；類芽孢桿菌屬主要有 Paenibacillus ginsenacillus sp.HGF5 ， Paenibacillus senegalensis ， Paenibacillus sp.Gclostridium。圖 1.2 基于屬水平的注釋結(jié)果Fig. 1.2 Assignment of sequences to bacteria in different genera
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本文編號(hào)：2865647