普魯蘭酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是一種淀粉脫支酶,能夠?qū)Ｒ恍缘刈饔糜谄蒸斕m糖、支鏈淀粉、極限糊精中的α-l,6糖苷鍵,切下整個(gè)側(cè)枝,形成直鏈淀粉,是淀粉加工業(yè)中的關(guān)鍵酶,在食品、釀造、醫(yī)療、化工等行業(yè)中也有著極大的應(yīng)用需求。本研究以淀粉廠污水為原料,旨在篩選出產(chǎn)普魯蘭酶優(yōu)勢菌株,對其進(jìn)行菌種鑒定,克隆出其普魯蘭酶基因并通過異源表達(dá)提高其發(fā)酵水平,研究純化后的重組酶的酶學(xué)性質(zhì),對國內(nèi)普魯蘭酶的開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。主要研究內(nèi)容如下:(1)通過以支鏈淀粉為唯一碳源進(jìn)行初篩,普魯蘭糖培養(yǎng)基進(jìn)一步鑒定,結(jié)合酶活力測定,從淀粉廠污水中分離篩選出一株產(chǎn)普魯蘭酶活力較高的菌株LK18(1.53±0.16 U/mL)。通過形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建等方法,將其鑒定為Paenibacillus puldeungensis,并命名為Paenibacillus puldeungensis LK18。(2)選取與Paenibacillus puldeungensis LK18的16S rDNA同源性較高的菌株的普魯蘭酶蛋白序列進(jìn)行多序列比對,通過CODEHOP法設(shè)計(jì)兼并引物,擴(kuò)增出部分普魯蘭酶編碼序列。然后根據(jù)該段基因序列的比對結(jié)果,進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出全長序列pulA,該基因全長1968 bp,編碼655個(gè)氨基酸。通過生物信息學(xué)分析,該酶為I型普魯蘭酶,屬于糖苷水解酶13家族。(3)構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-pulA,在E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)并初步探索其誘導(dǎo)條件,結(jié)果顯示:在22℃,IPTG終濃度為0.5 mmol/L的條件下誘導(dǎo)12 h,該重組酶的表達(dá)效果最好,酶活力可達(dá)248.52 U/mL。(4)通過鎳柱親和層析對最優(yōu)誘導(dǎo)條件下的粗酶液進(jìn)行純化,成功分離出重組蛋白,其分子量約為76.95 kDa,測定出重組酶的比酶活達(dá)508.8 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)研究表明:該重組酶的最適反應(yīng)溫度為45℃,最適pH為6.0,在35℃~40℃或pH 6.0~8.0條件下較為穩(wěn)定。10 mmol/L的K~+和Mg~(2+)對該重組酶有激活作用,Zn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)等對其有不同程度的抑制作用,其他離子對該酶無明顯作用。以普魯蘭糖為底物時(shí),該酶的Km值和Vmax值分別為3.69 mg/mL和384.62μmol/(min·mL)。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

圖 1-1 普魯蘭糖的水解方式Fig.1-1 Enzymatic degradation of pullulan 普魯蘭酶的產(chǎn)生菌種 1961 年 Bender 和 Wallenfels 首次從產(chǎn)氣氣桿菌 Aerobacter aerogene 中酶以來，研究人員從多種細(xì)菌、真菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)了普魯蘭酶的存在[1

us GK-24 75 5.5 65 構(gòu)與催化機(jī)理構(gòu)特征糖基水解酶 GH13 家族（又稱 α-淀粉酶家族），類都含有 4 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域（I~IV），共同組魯蘭酶也含有 4 個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域（表 1-3）， α 螺旋結(jié)構(gòu)的形成，它們組成了(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)疊桶第三個(gè) β 折疊和第三個(gè) α 螺旋之間的一個(gè)和活性口袋；結(jié)構(gòu)域 III 位于結(jié)構(gòu)域 I 的 C 端，結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域 IV 位于結(jié)構(gòu)域 I 的 N 端，是由反向平行 β 片層的 β 三明治型結(jié)構(gòu)[29]。

圖 2-1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1 The standard curve of glucose圖 2-1 所示，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用 DNS 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程11x-0.0227，相關(guān)系數(shù) R2=0.9984，表明在測定范圍內(nèi)，葡萄糖濃度和 OD的線性關(guān)系。菌種篩選過以支鏈淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，共挑選出 32 株碘液染色后能水解圈（圖 2-2a）的菌株，將其轉(zhuǎn)接到普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基進(jìn)一步鑒定， 6 株在普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出較大透明圈（圖 2-2b）的菌株。將這種到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)，通過 DNS 法測定其發(fā)酵上清液酶活力其中菌株 LK18 的酶活力最高，為 1.53±0.16 U/mL，將其作為后期研究的對
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2865498