普魯蘭酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是一種淀粉脫支酶,能夠專一性地作用于普魯蘭糖、支鏈淀粉、極限糊精中的α-l,6糖苷鍵,切下整個側枝,形成直鏈淀粉,是淀粉加工業(yè)中的關鍵酶,在食品、釀造、醫(yī)療、化工等行業(yè)中也有著極大的應用需求。本研究以淀粉廠污水為原料,旨在篩選出產普魯蘭酶優(yōu)勢菌株,對其進行菌種鑒定,克隆出其普魯蘭酶基因并通過異源表達提高其發(fā)酵水平,研究純化后的重組酶的酶學性質,對國內普魯蘭酶的開發(fā)和應用具有重要意義。主要研究內容如下:(1)通過以支鏈淀粉為唯一碳源進行初篩,普魯蘭糖培養(yǎng)基進一步鑒定,結合酶活力測定,從淀粉廠污水中分離篩選出一株產普魯蘭酶活力較高的菌株LK18(1.53±0.16 U/mL)。通過形態(tài)特征觀察、生理生化試驗、16S rDNA序列同源性分析及系統進化樹構建等方法,將其鑒定為Paenibacillus puldeungensis,并命名為Paenibacillus puldeungensis LK18。(2)選取與Paenibacillus puldeungensis LK18的16S rDNA同源性較高的菌株的普魯蘭酶蛋白序列進行多序列比對,通過CODEHOP法設計兼并引物,擴增出部分普魯蘭酶編碼序列。然后根據該段基因序列的比對結果,進一步設計引物擴增出全長序列pulA,該基因全長1968 bp,編碼655個氨基酸。通過生物信息學分析,該酶為I型普魯蘭酶,屬于糖苷水解酶13家族。(3)構建重組表達載體pET-28a(+)-pulA,在E.coli BL21(DE3)中進行異源表達并初步探索其誘導條件,結果顯示:在22℃,IPTG終濃度為0.5 mmol/L的條件下誘導12 h,該重組酶的表達效果最好,酶活力可達248.52 U/mL。(4)通過鎳柱親和層析對最優(yōu)誘導條件下的粗酶液進行純化,成功分離出重組蛋白,其分子量約為76.95 kDa,測定出重組酶的比酶活達508.8 U/mg。酶學性質研究表明:該重組酶的最適反應溫度為45℃,最適pH為6.0,在35℃~40℃或pH 6.0~8.0條件下較為穩(wěn)定。10 mmol/L的K~+和Mg~(2+)對該重組酶有激活作用,Zn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)等對其有不同程度的抑制作用,其他離子對該酶無明顯作用。以普魯蘭糖為底物時,該酶的Km值和Vmax值分別為3.69 mg/mL和384.62μmol/(min·mL)。
【學位單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

圖 1-1 普魯蘭糖的水解方式Fig.1-1 Enzymatic degradation of pullulan 普魯蘭酶的產生菌種 1961 年 Bender 和 Wallenfels 首次從產氣氣桿菌 Aerobacter aerogene 中酶以來，研究人員從多種細菌、真菌和古生菌中發(fā)現了普魯蘭酶的存在[1

us GK-24 75 5.5 65 構與催化機理構特征糖基水解酶 GH13 家族（又稱 α-淀粉酶家族），類都含有 4 個保守的結構域（I~IV），共同組魯蘭酶也含有 4 個這樣的結構域（表 1-3）， α 螺旋結構的形成，它們組成了(β/α)8桶狀結構疊桶第三個 β 折疊和第三個 α 螺旋之間的一個和活性口袋；結構域 III 位于結構域 I 的 C 端，結構；結構域 IV 位于結構域 I 的 N 端，是由反向平行 β 片層的 β 三明治型結構[29]。

圖 2-1 葡萄糖標準曲線Fig.2-1 The standard curve of glucose圖 2-1 所示，以葡萄糖為標準品，采用 DNS 繪制標準曲線，曲線方程11x-0.0227，相關系數 R2=0.9984，表明在測定范圍內，葡萄糖濃度和 OD的線性關系。菌種篩選過以支鏈淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基進行初篩，共挑選出 32 株碘液染色后能水解圈（圖 2-2a）的菌株，將其轉接到普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基進一步鑒定， 6 株在普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基上呈現出較大透明圈（圖 2-2b）的菌株。將這種到發(fā)酵培養(yǎng)基進一步發(fā)酵培養(yǎng)，通過 DNS 法測定其發(fā)酵上清液酶活力其中菌株 LK18 的酶活力最高，為 1.53±0.16 U/mL，將其作為后期研究的對
【參考文獻】

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本文編號：2865498