桂花(Osmanthus fragrans)具有較為特殊的開花過程和機制,成花轉變、花芽分化和花開放均受到環(huán)境溫度的影響。環(huán)境相對低溫能夠顯著促進桂花花芽分化進程,同時也調控花開放過程。觀察了不同溫度處理(25℃和19℃)對‘堰虹桂’花芽分化進程的影響,克隆得到7個SVP基因,并分析了這7個SVP基因及其4個下游相關基因在花芽分化進程中的表達模式,探究相對低溫影響花芽分化的機制以及SVP基因的作用;同時,分析3個擴展蛋白基因OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4的功能和作用,以明確其在相對低溫調控花開放中的作用機制。主要研究結果如下:1.相對低溫對花芽分化進程的影響:在不同溫度處理(25℃和19℃)中,相對低溫處理(19℃)可使‘堰虹桂’提前進入花芽分化,并且能加快整個花芽分化進程。其中受到相對低溫影響最為顯著的是花序分化期和雌蕊分化期,花序分化期縮短18 d,雌蕊分化期縮短26 d。2.OfSVP基因的克隆及其表達模式分析:從桂花中克隆得到7個SVP基因,ORF finder在線分析發(fā)現(xiàn)4個基因(OfSVP1,OfSVP3,OfSVP4,OfSVP5)具有完整的cDNA序列,OfSVP2、OfSVP6和OfSVP7基因5′端存在缺失。7個SVP基因氨基酸序列進行比對分析,OfSVPs具有SVP的主要保守特征,包括N端含有MADS-box、K-box和I-box基序,以及不保守C末端,系統(tǒng)進化樹分析表明7個OfSVP基因分別屬于2個亞族。對7個SVP基因和其他4個SVP下游基因進行熒光定量表達分析,OfSVP4/6/7在花芽分化過程中在相對低溫條件下下調表達,而OfSVP1上調表達,OfSVP2/3/5的表達量在不同溫度下沒有顯著差異。FT、SOC1和GA20ox2在19℃處理下的表達量基本上高于25℃處理,與OfSVP4/6/7表達呈顯著負相關。OfSVP4/6/7說明可能響應低溫促進花芽分化,其可能通過調控FT、SOC1以及GA20ox2而影響花芽分化進程。3.擴張蛋白OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4的功能分析:構建得到3個35S::OfEXPLA1-GFP、35S::OfEXPA2-GFP和35S::OfEXPA4-GFP重組植物表達載體,然后轉入洋蔥表皮細胞內,發(fā)現(xiàn)OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4蛋白的綠色熒光信號都定位在細胞壁上。通過改進后的花序侵染法獲得轉桂花OfEXP基因啟動子的擬南芥株系,通過表型觀察發(fā)現(xiàn)3種轉基因株系的葉片平均長度和平均寬度都長于野生型,OfEXPLA1和OfEXPA4啟動子轉基因擬南芥株系的平均花序長度長于野生型,其花序數(shù)量也多于野生型。OfEXPA2啟動子轉基因擬南芥株系的花序長度和數(shù)量與野生型比較,沒有顯著差異。
【學位單位】：浙江農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S685.13;Q943.2
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
1 文獻綜述
    1.1 花芽分化的研究進展
        1.1.1 不同植物中花芽分化的研究
        1.1.2 環(huán)境溫度調控植物花芽分化的研究
    1.2 SVP的功能和作用
        1.2.1 不同植物SVP家族及功能研究
        1.2.2 SVP響應環(huán)境溫度以調控植物開花的研究
    1.3 擴展蛋白在開花過程中的作用
        1.3.1 擴展蛋白的基本功能
        1.3.2 擴展蛋白對植物開花的影響
    1.4 目的與意義
2 相對低溫對桂花花芽分化進程的影響
    2.1 試驗材料
    2.2 試驗方法
        2.2.1 低溫處理方法
        2.2.2 花芽取樣
        2.2.3 石蠟切片制作與觀察
    2.3 結果與分析
        2.3.1 相對低溫處理對桂花花芽分化過程的影響
    2.4 討論
3 桂花OfSVP基因的克隆和序列分析
    3.1 試驗材料
    3.2 試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 引物設計
        3.3.2 樣品采集與保存
        3.3.3 桂花花芽RNA的提取
        3.3.4 RNA反轉錄cDNA
        3.3.5 PCR反應體系及程序
        3.3.6 目的片段回收
        3.3.7 pMD18-T載體連接
        3.3.8 LB培養(yǎng)基配置
        3.3.9 重組質粒轉化大腸桿菌
        3.3.10 挑菌及公司測序
        3.3.11 桂花OfSVP序列分析
        3.3.12 桂花OfSVP蛋白質分析預測
        3.3.13 桂花OfSVP氨基酸系統(tǒng)進化樹的構建
    3.4 結果與分析
        3.4.1 桂花OfSVP基因的克隆
        3.4.2 桂花SVP基因的氨基酸基本理化性質分析
        3.4.3 桂花SVP基因的氨基酸序列比對分析
        3.4.4 桂花SVP基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析
    3.5 討論
4 不同溫度條件下OfSVP基因及其他下游基因的表達分析
    4.1 試驗材料
    4.2 試驗試劑
    4.3 試驗方法
        4.3.1 桂花花芽RNA的提取
        4.3.2 熒光定量表達分析
    4.4 結果與分析
        4.4.1 不同溫度處理下OfSVPs基因在花芽分化進程中的表達
        4.4.2 不同溫度處理下其他OfSVP下游基因在花芽分化進程中的表達
    4.5 討論
5 桂花擴展蛋白基因的亞細胞定位
    5.1 試驗材料
    5.2 主要試劑
    5.3 實驗方法
        5.3.1 設計引物
        5.3.2 RNA的提取
        5.3.3 cDNA的反轉錄
        5.3.4 PCR擴增
        5.3.5 回收目的片段
        5.3.6 目的片段的雙酶切
        5.3.7 pCAMBIA1301-35S-GFP表達載體質粒的雙酶切
        5.3.8 pCAMBIA1301-35S-GFP載體的連接
        5.3.9 連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌
        5.3.10 挑菌及測序
        5.3.11 質粒提取
        5.3.12 根癌農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細胞的制備
        5.3.13 凍融法轉化農(nóng)桿菌
        5.3.14 農(nóng)桿菌浸潤
    5.4 結果與分析
        5.4.1 植物表達載體的構建及轉化農(nóng)桿菌結果
        5.4.2 擴展蛋白的亞細胞定位情況
    5.5 討論
6 桂花OfEXP基因啟動子轉化擬南芥分析
    6.1 實驗材料
    6.2 主要試劑
    6.3 實驗方法
        6.3.1 擬南芥材料的準備
        6.3.2 農(nóng)桿菌的準備
        6.3.3 轉化擬南芥植株
        6.3.4 種子采收
        6.3.5 轉基因擬南芥的篩選
        6.3.6 轉基因擬南芥DNA提取
        6.3.7 轉基因擬南芥PCR檢測
        6.3.8 轉基因擬南芥T2 代的檢測
        6.3.9 轉基因擬南芥T2 代葉片觀察
    6.4 結果與分析
        6.4.1 OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4 啟動子轉化擬南芥的功能分析
    6.5 討論
7 主要結論與展望
    7.1 主要結論
    7.2 展望
個人簡介
致謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 趙宏波;郝日明;胡紹慶;;中國野生桂花的地理分布和種群特征[J];園藝學報;2015年09期

2 李巍;徐啟江;;被子植物開花時間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調控研究進展[J];園藝學報;2014年06期

3 張遲;周廬萍;羅小燕;孫小明;秦巧平;周明兵;崔永一;;低溫對朵麗蝶蘭成花過程中碳水化合物及糖轉運蛋白基因表達的影響[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2011年08期

4 吳莉英;唐前瑞;尹恒;陳麗;;觀賞植物花芽分化研究進展[J];生物技術通訊;2007年06期

5 王金剛;廉利;車代弟;;唐菖蒲花芽分化超微結構觀察[J];東北農(nóng)業(yè)大學學報;2006年02期

6 劉曉榮;王碧青;朱根發(fā);程智慧;;高山低溫誘導蝴蝶蘭花芽分化過程中的生理變化[J];中國農(nóng)學通報;2006年04期

7 李琳琳;史益敏;;郁金香種球冷藏與花期調控[J];上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版);2006年01期

8 賀海洋,朱金啟,高琪潔,上田善弘,蕓學部,高俊平,胡建芳;單葉薔薇的花芽形態(tài)分化[J];園藝學報;2005年02期

9 萬云先;桂花花芽分化的研究[J];華中農(nóng)業(yè)大學學報;1988年04期

10 楊康民,朱文江,蔣永明,王家元,王元松;桂花開花物候期的劃分及其采收期的調查研究[J];園藝學報;1986年04期

本文編號：2864105