發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 04:11

　　 細(xì)胞受到病毒感染,氧化損傷等應(yīng)激時(shí),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累大量的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)。為了維持細(xì)胞內(nèi)的蛋白穩(wěn)態(tài),細(xì)胞通過增強(qiáng)蛋白折疊、加速未折疊蛋白質(zhì)的降解等方式清除未折疊的蛋白質(zhì),該過程被稱為未折疊蛋白壓力應(yīng)答(unfolded protein response,UPR)。該應(yīng)答過程主要發(fā)生在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩個(gè)細(xì)胞器,分別為線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白壓力應(yīng)答,即UPR~(mt)和UPR~(ER)。已有研究發(fā)現(xiàn),UPR~(mt)和UPR~(ER)能力與生物體衰老密切相關(guān)。在生物體衰老進(jìn)程中,UPR~(mt)或者UPR~(ER)的應(yīng)答能力發(fā)生下降。而激活秀麗線蟲UPR~(mt)或者UPR~(ER)能夠延長(zhǎng)線蟲的壽命。秀麗線蟲是研究衰老調(diào)控的經(jīng)典模式生物之一。本實(shí)驗(yàn)室已有的研究發(fā)現(xiàn),具有組蛋白H3K36二甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SET-18,通過與哺乳動(dòng)物高度保守的Insulin/IGF-1信號(hào)通路促進(jìn)線蟲衰老。SET-18通過對(duì)該信號(hào)通路中的FOXO轉(zhuǎn)錄因子daf-16a的啟動(dòng)子進(jìn)行H3K36me2修飾,抑制了daf-16a轉(zhuǎn)錄,從而加速了衰老進(jìn)程。但是SET-18對(duì)衰老的促進(jìn)作用是通過調(diào)控何種細(xì)胞活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)的,目前仍不清楚。由于SET-18主要在線蟲肌肉特異性表達(dá),而肌肉是相應(yīng)UPR~(mt)和UPR~(ER)的重要場(chǎng)所。另外有研究發(fā)現(xiàn),與SET-18同源的哺乳動(dòng)物中SMYD1基因參與UPR~(ER)反應(yīng)。因此,本論文將就SET-18是否調(diào)控UPR~(mt)和UPR~(ER)進(jìn)行探討。HSP-6和HSP-60是應(yīng)答UPR~(mt)的主要標(biāo)記基因。我們首先利用雜交技術(shù),構(gòu)建了帶有hsp-6::GFP和hsp-60::GFP的set-18(gk334)突變體線蟲。經(jīng)基因型鑒定構(gòu)建成功后,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),set-18基因缺失不影響HSP-6和HSP-60的表達(dá)水平。在通過RNAi抑制細(xì)胞色素C氧化酶cco-1而誘發(fā)UPR~(mt)的情況下,野生型線蟲N2和set-18(gk334)突變體線蟲中HSP-6和HSP-60的表達(dá)水平仍然接近。由此說明,SET-18不參與UPR~(mt)過程的調(diào)控。HSP-4是應(yīng)答UPR~(ER)的主要標(biāo)記基因。我們通過雜交技術(shù)和基因型鑒定,首先成功構(gòu)建了帶有hsp-4::GFP的set-18(gk334)突變體線蟲,然后我們分別對(duì)帶有該GFP標(biāo)簽的野生型N2和set-18(gk334)突變體線蟲進(jìn)行熱激和衣霉素(tunicamycin,TM)處理以激活UPR~(ER)。我們發(fā)現(xiàn),day 1時(shí)期(成蟲第一天)的N2線蟲在熱激和TM處理后,HSP-4的表達(dá)水平明顯提高。但是day 1時(shí)期的set-18(gk334)突變體線蟲中,熱激和TM處理和未處理,HSP-4的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。這說明,set-18基因缺失影響了UPR~(ER)應(yīng)答的過程。另外,我們又檢測(cè)了線蟲衰老進(jìn)程,即從成蟲第三天到第11天,set-18(gk334)突變體線蟲應(yīng)答UPR~(ER)的情況。我們發(fā)現(xiàn),隨著衰老進(jìn)程,野生型N2線蟲應(yīng)答由TM誘導(dǎo)的UPR~(ER)的能力逐漸減弱。但對(duì)于不同衰老程度(day 1、day 3、day7、day 11)的set-18(gk334)突變體線蟲,TM處理都不能激活HSP-4的表達(dá)。這說明SET-18對(duì)UPR~(ER)的調(diào)控并不隨著衰老進(jìn)程而發(fā)生變化。另外,我們?cè)趕et-18(gk334)突變體線蟲針對(duì)SET-18的靶基因daf-16進(jìn)行RNAi處理,發(fā)現(xiàn)daf-16RNAi并不影響set-18基因缺失對(duì)UPR~(ER)應(yīng)答的影響。以上研究表明,組蛋白H3K36me2甲基轉(zhuǎn)移酶SET-18,參與UPR~(ER)調(diào)控過程,但不參與UPR~(mt)調(diào)控。另外,SET-18對(duì)UPR~(ER)的調(diào)控不隨著衰老而發(fā)生改變,且不依賴DAF-16的活性。該研究為進(jìn)一步探討組蛋白H3K36me2修飾促進(jìn)衰老的細(xì)胞學(xué)機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q75
【部分圖文】：

也會(huì)啟動(dòng) UPRmt[3]。.線粒體未折疊蛋白壓力應(yīng)答（UPRmt）的調(diào)控秀麗線蟲為模型進(jìn)行的 UPRmt相關(guān)研究為 UPRmt的調(diào)控機(jī)制提供了重研究發(fā)現(xiàn)，線蟲中 ATFS-1（activating transcription factor associatedress-1）是具有亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper domain，bZIP）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)當(dāng)發(fā)生 UPRmt時(shí)，主要是由 ATFS-1 調(diào)控的。ATFS-1 的 N 端含有向線的信號(hào)序列 MTS（mitochondrial targeting sequence），其 C 端含有向細(xì)的信號(hào)序列 NLS（nuclear localization signal）。線粒體在受到未折疊蛋況下，ATFS-1 向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑受到影響，造成 ATFS-1 堆積在細(xì)胞后經(jīng)由其 C 端的 NLS 序列轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中（圖 1.1）。ATFS-1 入核后5（ubiquitin-like protein 5）及 DVE-1（defective proventriculus protein 1）復(fù)合物，并與核 DNA 結(jié)合，誘導(dǎo)線粒體的分子伴侶和蛋白酶等基因熱休克蛋白 HSP60 和 HSP6 的轉(zhuǎn)錄[4,21-23]。

多肽可以通過 HAF-1 轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜間隙中。當(dāng) ClpP 或 HAF-1 基因功能障礙，則導(dǎo)致UPRmt通路信號(hào)減弱。另外，UPRmt的激活可誘導(dǎo)UBL-5（ubiquitin-like protein5）基因的轉(zhuǎn)錄，UBL-5 與 DVE-1（defective proventriculus protein 1）結(jié)合形成的復(fù)合物可以調(diào)控線粒體分子伴侶的表達(dá)。DVE-1 定位于核仁，當(dāng)發(fā)生 UPRmt時(shí)，DVE-1 結(jié)合到線粒體分子伴侶基因的啟動(dòng)子上，調(diào)控基因的表達(dá)，促進(jìn)線粒體熱休克蛋白 HSP60 基因的表達(dá)[3,17,23,24]（圖 1.2）。

圖 1.3 哺乳動(dòng)物調(diào)控 UPRER信號(hào)通路，引自 Senft D,Ronai Z EA[39]二、生物體衰老的調(diào)控（一）衰老的標(biāo)志衰老是生物體必須經(jīng)歷的生理過程，衰老的機(jī)體或細(xì)胞對(duì)各種外界或內(nèi)部的的抵抗能力都隨著衰老而降低。作為生物體內(nèi)較為復(fù)雜的生理過程，衰老的受到許多因素的調(diào)控，包括體內(nèi)的調(diào)控衰老的信號(hào)通路中基因突變和染色體常改變，以及外界環(huán)境的改變[40]。衰老標(biāo)志分為三類[40]。第一類標(biāo)志是被認(rèn)為是造成細(xì)胞損傷的主要原因，基因組不穩(wěn)定、表觀遺傳改變、端粒長(zhǎng)度消減、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致。第二志對(duì)于輕度的細(xì)胞損傷是有抵抗能力的，可以使細(xì)胞恢復(fù)功能。包括營(yíng)養(yǎng)感調(diào)、細(xì)胞衰老、線粒體功能發(fā)生障礙。但是細(xì)胞損害程度較為嚴(yán)重或者持續(xù)長(zhǎng)，那么這類將對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。第三類標(biāo)志是干細(xì)胞耗竭和細(xì)胞間通訊改圖 1.4），這類標(biāo)志是由于前兩類導(dǎo)致的最終結(jié)果，造成衰老相關(guān)的功能衰退
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