在哺乳動(dòng)物中,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator transcription 3,STAT3)能被細(xì)胞因子激活,是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游基因。近年來(lái)的研究表明,STAT3不僅存于核內(nèi),而且核外也有STAT3。于核內(nèi),STAT3被激活,靶向下游基因,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬,于核外,STAT3與PKR相作用,通過(guò)調(diào)節(jié)eIF2α調(diào)節(jié)自噬。哺乳動(dòng)物中,IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活以及新陳代謝。在本文中,我們分別使用自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin和Tunicamycin對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激,熒光定量檢測(cè)草魚白介素6受體(CiIL-6r)的表達(dá),結(jié)果顯示其表達(dá)降低,但當(dāng)使用人源重組白介素6(rIL-6)短時(shí)間處理后,CiIL-6r的表達(dá)增加,并且超過(guò)空白對(duì)照組。我們認(rèn)為rIL-6可能抑制了自噬。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬指示蛋白LC3,自噬誘導(dǎo)劑處理(Rapamycin和Tunicamycin)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值分別為0.84和4.7,相對(duì)于對(duì)照組,自噬增強(qiáng),IL-6短時(shí)間作用后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低至0.45和0.69,即自噬情況減輕。除此之外,我們通過(guò)將重組質(zhì)粒GFP-CiLC3轉(zhuǎn)染至草魚CIK細(xì)胞,經(jīng)過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光,證實(shí),自噬誘導(dǎo)劑Tunicamycin(Rapamycin)能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬,但經(jīng)過(guò)IL-6短時(shí)間作用后,自噬情況減輕。我們認(rèn)為rIL-6抑制了自噬。為驗(yàn)證STAT3是否參與rIL-6抑制了自噬過(guò)程,我們分別使用自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin和Tunicamycin對(duì)細(xì)胞進(jìn)行梯度時(shí)間刺激,熒光定量檢測(cè)CiSTAT3的表達(dá),結(jié)果顯示STAT3一直處于被抑制的狀態(tài),并且在24h達(dá)到最低,當(dāng)細(xì)胞處于自噬誘導(dǎo)劑Tunicamycin作用下,使用rIL-6作用能使得CiSTAT3表達(dá)增加。我們認(rèn)為STAT3參與自噬過(guò)程。接下來(lái)我們將重組質(zhì)粒FLAG-tagged CiSTAT3與GFP-tagged CiSTAT3共轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞中,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CO-IP)表明無(wú)IL-6作用下,CiSTAT3不會(huì)自身形成二聚體,而IL-6作用下,CiSTAT3形成二聚體,說(shuō)明魚類STAT3被IL-6所激活。在哺乳動(dòng)物中,Bcl-2是STAT3的下游靶基因,并且,其不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,而且還參與細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)。熒光定量結(jié)果也顯示,自噬誘導(dǎo)劑Tunicamycin作用下BCL-2表達(dá)降低,在IL-6作用下,Bcl-2表達(dá)量升高,與IL-6R、STAT3情況相一致。為驗(yàn)證CiSTAT3是否能激活CiBcl-2基因的表達(dá),我們將分別將pCDNA3.1-ORF-CiSTAT3與pGL3-CiBcl-2、pCDNA3.1-Basic與pGL3-CiBcl-2共轉(zhuǎn)到CIK細(xì)胞,檢測(cè)Bcl-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。雙熒光素酶活性分析結(jié)果顯示,CiSTAT3能上調(diào)CiBcl-2的轉(zhuǎn)錄活性,使之大量表達(dá)。Bcl-2作為抗凋亡基因,其與BAX這個(gè)基因表達(dá)的比值能反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況。我們使用One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況,結(jié)果顯示,自噬誘導(dǎo)劑TM會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡,但在加入IL-6短時(shí)間孵育后,細(xì)胞凋亡減輕。除此之外,我們還使用CCK8對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表面,自噬誘導(dǎo)劑TM使得細(xì)胞活性降低,但在IL-6短時(shí)間作用后,細(xì)胞活性有所回升。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q25
【部分圖文】：

圖 3.1B 草魚 LC3 蛋白在 CIK 細(xì)胞中的表達(dá)Fig 3.1B Expression of CiLC3 protein levels in CIK ce 檢測(cè) CiLC3 和 CiGAPDH。設(shè) CiGAPDH 灰度值為相對(duì)于 CiGAPDH 的灰度值。

CGFP-LC3的免疫熒光檢測(cè)

草魚 BCL-2 蛋白與斑馬魚、鯉魚親緣關(guān)系較近(圖3.4)。通過(guò) NCBI 進(jìn)行 BLAST 核苷酸序列分序，其與斑馬魚相似度達(dá)到 90%。圖 3.4 草魚 BCL-2 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 3.4 Phylogenetic tree of CiBCL-2MEGA 7 軟件比對(duì) 19 個(gè)物種 BCL-2 的蛋白序列，從上到下依次是斑馬魚、草魚(已標(biāo)記)、鯉魚、白鮭、鱸魚、犬、褐家鼠、智人、山羊、家貓、東方鲀、銀漢魚、河蜆、水螅、果蠅、白蝦、蟹、菜蛾、牛皰疹病毒 4。3.5 草魚 STAT3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控草魚 BCL-23.5.1 草魚 STAT3 能上調(diào)草魚 BCL-2 啟動(dòng)子活性將構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pCDNA3.1-STAT3(或 pCDNA3.1-Basic)、pGL3-BCL-2 以及帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 CIK 細(xì)胞，檢測(cè)雙熒光素酶活性(圖 3.5A)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)草魚 STAT3 能使得 BCL-2 啟動(dòng)子活性顯著提升。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 牟婕;馮文靜;王珊;馮美蘋;毛擁軍;;自噬調(diào)控衰老的研究進(jìn)展[J];中華老年多器官疾病雜志;2019年01期

2 李黎;季漪;李文婷;馬艷霞;李沐涵;吳勉華;;基于細(xì)胞自噬的中醫(yī)藥抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J];中華中醫(yī)藥雜志;2019年01期

3 汪艷;;調(diào)控自噬在臨床肝病治療性應(yīng)用的轉(zhuǎn)化研究[J];肝臟;2019年07期

4 韓蘇夏;蔡夢(mèng)嬌;;自噬在腫瘤治療策略中的角色[J];西部醫(yī)學(xué);2018年09期

5 周岐鳴;劉洋;季光;宋海燕;;調(diào)節(jié)自噬改善非酒精性脂肪性肝病的藥物研究進(jìn)展[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2018年10期

6 李曉瓊;何玲玲;李新毅;;自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究進(jìn)展[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2018年10期

7 馬文科;戴舒惠;羅鵬;楊悅凡;費(fèi)舟;;線粒體自噬的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年06期

8 付婉;董笛;趙穎;;自噬的相關(guān)分子機(jī)制[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2017年05期

9 方聰聰;毛善平;董慧敏;劉寶輝;王舜;;線粒體自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];卒中與神經(jīng)疾病;2017年02期

10 李旭卉;吳習(xí)習(xí);張凱;羅海霞;李敏;;線粒體自噬與癌癥關(guān)系的研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 閆冬瑩;錳誘導(dǎo)的α-synuclein蛋白寡聚體與自噬的相互作用對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的分子機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

2 高祥;鑭對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的影響及其相關(guān)機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

3 劉婷婷;GSK-3β調(diào)節(jié)自噬影響DCD供肝缺血再灌注損傷機(jī)制的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

4 史勱;STAT5調(diào)控自噬在腎小球系膜細(xì)胞衰老過(guò)程中的作用及氯沙坦對(duì)其的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

5 郭劍波;LncRNA CCAT1在肝細(xì)胞癌中通過(guò)海綿吸附miR-181上調(diào)ATG7促進(jìn)自噬的機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

6 馮浩;自噬抵抗細(xì)胞上皮—間葉樣表型轉(zhuǎn)化進(jìn)程維持視網(wǎng)膜色素上皮穩(wěn)態(tài)[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

7 張華璐;鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體Zip7對(duì)線粒體自噬的調(diào)控作用及分子機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

8 張斌;自噬在高碘誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞及大鼠海馬組織凋亡中的作用研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

9 李琦;MST1激活JNK/p53通路抑制線粒體自噬調(diào)控直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

10 李永麗;STAT3、自噬在非酒精性脂肪性肝炎炎癥中的作用及二甲雙胍抗炎機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2019年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王雨;miR-122通過(guò)靶定PKM2調(diào)節(jié)自噬影響砷誘導(dǎo)的雞肝損傷[D];東北林業(yè)大學(xué);2019年

2 田凈凈;K-115調(diào)控自噬抑制人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞活化[D];河北北方學(xué)院;2019年

3 黃健妮;激素治療FSGS療效探討及自噬和MCP-1水平在COL4A3突變相關(guān)腎病中的作用[D];上海交通大學(xué);2018年

4 馮一吉;自噬參與Aβ介導(dǎo)的RPE細(xì)胞炎癥的作用及機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2018年

5 謝潔;VDAC1介導(dǎo)的線粒體自噬活化NLRP3炎癥體在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用機(jī)制研究[D];華南理工大學(xué);2019年

6 彭鑫;冬眠達(dá)烏爾黃鼠骨骼肌中自噬水平的變化與調(diào)控機(jī)制的研究[D];西北大學(xué);2019年

7 陳思;miR-101通過(guò)靶向Atg4D抑制矽肺大鼠肺泡巨噬細(xì)胞自噬的作用研究[D];華北理工大學(xué);2019年

8 楊靜亞;ATG4D對(duì)染塵后大鼠肺泡巨噬細(xì)胞自噬流的影響[D];華北理工大學(xué);2019年

9 楊越;IP_3R在TOCP調(diào)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞自噬中的作用與機(jī)制[D];南華大學(xué);2019年

10 羅浩蕩;肺炎支原體膜脂質(zhì)經(jīng)TLR4和自噬途徑調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子[D];南華大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2855142