開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要標志,出苗到開花所需時長受到外在環(huán)境和內(nèi)在基因共同調(diào)控。FT基因家族是植物中多條開花調(diào)控途徑的重要整合因子,在擬南芥中過量表達FT基因可促進其開花。在大豆中有10個FT同源基因,除GmFT2a、GmFT5a和GmFT1a基因功能在大豆中得以驗證,其余仍有多個FT基因功能尚未明確。本研究通過對大豆FT家族中GmFT3a基因進行克隆和相關(guān)功能研究,由此為深入研究大豆開花分子機制提供理論依據(jù),并為培育不同光周期敏感性和廣適應性大豆準備育種材料。本實驗從光周期敏感的自貢冬豆中克隆GmFT3a基因,運用生物信息學相關(guān)軟件及網(wǎng)站對該基因及其啟動子序列進行分析,采用實時熒光定量方法檢測GmFT3a在不同生育期組大豆材料、不同組織部位的表達量和48h表達模式,通過構(gòu)建P16318-GmFT3a-GFP融合表達載體對擬南芥原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化并完成蛋白亞細胞定位,利用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別獲得擬南芥和大豆GmFT3a過表達植株,分析其開花表型及開花調(diào)控相關(guān)基因的表達情況,明確其在開花途徑中的分子功能。主要結(jié)果如下:1.GmFT3a基因位于大豆基因組16號染色體上,CDS區(qū)528bp,編碼175個氨基酸,其中第27至第164位氨基酸為保守性較高的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidyl Ethanolamine-Binding Protein,PEBP)家族結(jié)構(gòu)域。GmFT3a蛋白三級結(jié)構(gòu)與AtFT和GmFT2a蛋白高度相似。GmFT3a上游啟動子中含有組織特異性表達元件、光響應元件、赤霉素響應元件和溫度響應元件。在大豆中GmFT3a與GmFT3b蛋白同源性最高,其次為GmFT2a蛋白。2.實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)GmFT3a基因在大豆不同組織中均有表達但在三出復葉中表達量最高;48h內(nèi)表達分析結(jié)果表明GmFT3a無明顯的晝夜節(jié)律,但在光照后4h出現(xiàn)表達峰值;不同生育期組大豆品種中表達量測定結(jié)果表明在長日條件下,生育期組(MG)000組和(MG)VII組的表達量要高于其它各組;在短日條件下,高生育期組(MG)000和(MG)00兩組中的GmFT3a的表達量要高于其它各組。3.擬南芥原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)化的亞細胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn),GmFT3a蛋白在細胞質(zhì)和細胞核中表達,同GmFT2a一致,表明GmFT3a可能具有轉(zhuǎn)錄因子的活性。4.在長日條件下,過表達GmFT3a轉(zhuǎn)基因擬南芥植株出現(xiàn)極顯著早花表型(P0.01),各過表達GmFT3a株系開花平均時間相比于野生型擬南芥的開花時間提前3.3天(P0.01);各過表達擬南芥株系平均葉片總數(shù)(莖生葉+蓮座葉)與野生型擬南芥相比減少29.5%,呈極顯著減少(P0.01);過表達擬南芥植株中內(nèi)源基因FT、CO和SOC1基因的表達量均極顯著升高(P0.01),表明GmFT3a基因在擬南芥中的過表達促進其內(nèi)源FT基因和其它與開花調(diào)控相關(guān)基因的表達量升高。5.在長日條件下,大豆T_2代過表達GmFT3a轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)顯著早花表型(P0.05),各株系平均開花時間相比于對照的開花時間提前6.2天;但在短日照條件下其開花時間并無顯著改變(P0.05);長日條件下T_2代轉(zhuǎn)基因植株中GmFT3a、GmFT3b和GmFT1b的表達量極顯著升高(P0.01),而GmFT2a、GmFT5a和GmFT1a的表達量極顯著下降(P0.01),表明GmFT3a基因與FT基因家族其它基因可能存在功能冗余或互補關(guān)系,起促進和抑制開花功能的基因在不同情況下基因表達量發(fā)生變化,符合“蹺蹺板”模型提出的開花分子調(diào)控機制。綜上研究結(jié)果,結(jié)合過表達GmFT3a轉(zhuǎn)基因大豆植株出現(xiàn)顯著早花表型及開花調(diào)控相關(guān)基因的表達量結(jié)果,說明GmFT3a對開花起潛在促進作用。通過GmFT3a基因功能研究,可為進一步解析大豆FT基因家族對大豆開花調(diào)控通路的分子機制提供理論參考。
【學位單位】：哈爾濱師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S565.1
【部分圖文】：

k/services/ ） 蛋 白 跨 膜 預 測 k/services/）進行信號肽預測；（https://web.expasy.org/protparam/）b.expasy.org/protscale/）預測；蛋白et.org/software/TMPＲED_form.htmLrabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?p感型大豆品種自貢冬豆為材料，提為 cDNA，以 GmFT3a-F 和 GmFT3a(圖 2-1)，將目的片段連接至 pLB 測體培養(yǎng)基上倒置37°進行培養(yǎng)后挑單測序并進行序列比對。

ǖ?27 個氨基酸到第 164 個氨基酸）的 PEBP 結(jié)構(gòu)域（圖2-4）。圖 2-4 自貢冬豆 GmFT3a 氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析Fig.2-4 The structure analysis of GmFT3a in Zigongdongdou

圖 2-2 GmFT3a 基因菌液 PCR 檢測M：分子量標準； 1-8：菌液 PCR 產(chǎn)物；9：陽性對照；H2O：陰性對照。Fig 2-2 Clony PCR checking of GmFT3aM: Maeker; 1-8: products of the clony pcr；9: positive control.;H2O:negative control2.3.2GmFT3a 基因的生物信息學分析2.3.2.1GmFT3a 基因的序列分析測序結(jié)果與大豆 Phytozome 中公布的威廉姆斯品種中的 GmFT3a 相一致，為我們的目的基因 GmFT3a。GmFT3a 開放閱讀框長度為 528bp，編碼 175 個氨酸（圖 2-3）。圖 2-3 GmFT3a cDNA 序列Fig.2-3 The cDNA sequences of GmFT3a使用 NCBI 進行 GmFT3a 保守結(jié)構(gòu)域在線分析網(wǎng)站預測可知該基因編碼的氨
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