發(fā)布時(shí)間：2020-10-22 17:02

　　 MicroRNA(miRNA)是一類其長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸并且具有調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA。自從miRNA被發(fā)現(xiàn)以來,miRNA的功能作用和特異性表達(dá)等研究報(bào)道接踵而至,到如今miRNA已經(jīng)被科學(xué)家鑒定為是參與各種生物生命活動(dòng)的重要因子,包括細(xì)胞的增殖和分化、人類疾病的自身免疫以及生物與非生物脅迫等。MiR159基因家族是植物學(xué)領(lǐng)域中最古老,最保守的miRNA家族之一,其進(jìn)化祖先能追溯到苔蘚類。目前研究發(fā)現(xiàn)該家族包括三個(gè)成員,分別是miRl59a、miRl59b、miRl59c,其中最主要的成員是miRl59a和miRl59b。miR159主要的靶基因?yàn)镸YB類轉(zhuǎn)錄因子,常見的有MYB33、MYB65、MYB97、MYB101等。MiR159基因家族功能豐富,不僅參與植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng),還參與生物和非生物脅迫。miR159靶基因MYB33的過表達(dá)導(dǎo)致葉片較小,葉柄較短,miR159a和miR159b功能缺失的突變體不能形成完整的花,miRl59b調(diào)控番茄種子發(fā)育等。雖然對(duì)miR159在多種植物中的功能有一定的研究,但對(duì)其在植物觀賞性狀發(fā)育中的作用研究不多。本實(shí)驗(yàn)擬運(yùn)用基因敲除和超量表達(dá)的方法探究miR159在觀賞植物矮牽牛中的功能,實(shí)驗(yàn)取得了以下研究成果:1.矮牽牛miRl59a和miRl59b基因敲除載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因植株的獲得利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),分別設(shè)計(jì)兩個(gè)靶位點(diǎn)來構(gòu)建miRl59a和miRl59b基因敲除載體,通過農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化矮牽牛,經(jīng)過Basta篩選后得到了抗性株系,采用CTAB法提取抗性株系的DNA,進(jìn)一步PCR、凝膠電泳檢測(cè)觀察發(fā)現(xiàn)有3個(gè)抗性株系的條帶有片段缺失的現(xiàn)象,最后經(jīng)測(cè)序鑒定,確認(rèn)了3個(gè)發(fā)生片段缺失的miRl59b基因敲除突變體株系,分別命名為639-2,5,6(其中639-2與639-5的突變類型完全一致)。2.MiR159b基因敲除突變體的表型觀察將基因敲除植株的組培苗移栽至田間管理,進(jìn)行初步觀察并收集種子,然后播種進(jìn)而對(duì)Genome Editing 1(E1)代突變體進(jìn)行表型觀察和數(shù)據(jù)分析:miRl59b基因敲除突變體與野生型矮牽牛相比,葉片面積變大,株高變高,現(xiàn)蕾期的葉片數(shù)增多,開花時(shí)間略晚。提取植株花蕾總RNA并經(jīng)熒光定量分析發(fā)現(xiàn):MYB1在miRl59bE1代突變體中的表達(dá)量高于野生型,而MYB2在miRl59bE1代突變體中的表達(dá)量低于野生型。3.miRl59b超量表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)矮牽�；蚪M設(shè)計(jì)miRl59b基因的引物序列miR159b-F/miRl59b-R,從野生型矮牽牛中克隆得到miRl59b基因,將目的基因與克隆載體pMD19-T連接構(gòu)建中間載體,然后分別酶切pG605和miRl59b基因超量表達(dá)的中間載體,進(jìn)而連接構(gòu)建miRl59b超量表達(dá)載體,為進(jìn)一步分析miRl59b基因的功能提供有利條件。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S681.9;Q943.2
【部分圖文】：

3.3 結(jié)果與分析3.3.1 矮牽牛 miR159a 基因敲除載體的構(gòu)建以 pUC119-AtU6-gRNA 為模板，使用引物 M13F+159a-sgR1 和 M13R+159a-sgF1 進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，得到片段一和片段二（如圖 3-1），再以片段一和片段二為混合模板，使用引物 M13F+M13R 進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，膠回收得到片段三（如圖 3-2）。用 KpnI 和 XhoI 分別酶切片段三和 pcoCas9 質(zhì)粒，膠回收目的條帶，將片段三的目的片段連接到 pcoCas9 質(zhì)粒的載體片段上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR驗(yàn)證，將檢測(cè)出條帶的菌液送測(cè)，測(cè)序正確后命名為 pG638-M。以 T617N-1 為模板，使用引物 M13R+159a-sgR2 和 M13F+159a-sgF2 進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，得到片段一和片段二（如圖 3-3），再以片段一和片段二的混合物為模板，使用引物 M13F+M13R 進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，膠回收得到片段三（如圖 3-4）。用 EcoRI+XbaI 分別酶切片段三和 pG638-M 質(zhì)粒，將目的片段連接到 pG638-M和質(zhì)粒的載體片段上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng) PCR 和凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證，測(cè)序正確后命名為 pG638（如圖 3-5），載體見圖如 3-6 所示。

圖 3-2 pG638-M 片段三的電泳檢測(cè)圖Fig.3-2 Electrophoretic detection of pG638-M fragments 3圖中泳道 1 為 Maker DL2000，泳道 2，3 為片段三。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 3.圖 3-3 重疊 PCR 合成靶點(diǎn)二的 sgRNA 序列Fig.3-3 Overlapping PCR to synthesize sgRNA sequence of target 2泳道 1 為 Maker DL2000，泳道 2，3 為片段二，泳道 4，5 為片段gure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 2, Lane 4, 5 is f

圖 3-3 重疊 PCR 合成靶點(diǎn)二的 sgRNA 序列Fig.3-3 Overlapping PCR to synthesize sgRNA sequence of target 2圖中泳道 1 為 Maker DL2000，泳道 2，3 為片段二，泳道 4，5 為片段一。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 2, Lane 4, 5 is fragment 1.圖 3-4 pG638 片段三的電泳檢測(cè)圖Fig.3-4 Electrophoretic detection of pG638 fragments 3圖中泳道 1 為 Maker DL2000，泳道 2，3，4，5，6 為片段三。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3, 4, 5, 6 is fragment 3.
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 邱勇波;羅鳳霞;白瑞琴;張麗;;熱脅迫下矮牽牛幼苗的形態(tài)和生理變化[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年01期

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本文編號(hào)：2851863