細(xì)胞在生長過程中伴隨著各種行為。其中,細(xì)胞粘附是研究其他細(xì)胞行為的基礎(chǔ),細(xì)胞只有首先與材料粘附,才能進(jìn)行其他遷移、分化、增殖等行為。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由大量納米尺度的纖維類結(jié)構(gòu)組成,具有強烈的細(xì)胞行為誘導(dǎo)作用。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)三維微納米基底可以模擬細(xì)胞外基質(zhì),且對細(xì)胞有很強的“接觸引導(dǎo)”作用,它允許細(xì)胞沿納米結(jié)構(gòu)的方向產(chǎn)生定向行為,因此可用于研究細(xì)胞粘附期間的定向行為。然而,目前研究各種三維結(jié)構(gòu)上細(xì)胞行為的方法仍以光學(xué)方法為主,此類方法依賴于終點檢測,不能及時反饋動態(tài)信息。細(xì)胞交流阻抗技術(shù)是一種能夠?qū)崟r、原位監(jiān)測細(xì)胞行為的方法,在細(xì)胞無標(biāo)記、無損傷的狀態(tài)下能獲得細(xì)胞生長時重要的動態(tài)信息,具有一定的應(yīng)用前景。在多細(xì)胞生物體內(nèi),細(xì)胞相互之間的交流也是一種重要的行為,通過細(xì)胞間信息交流,生物體保證了組織內(nèi)不同類型細(xì)胞間的相互協(xié)調(diào)。外泌體是由細(xì)胞分泌的一種納米囊泡,其含有各種活性成分,例如DNA,RNA和源自母細(xì)胞的蛋白質(zhì),并且是重要的細(xì)胞信號通信工具。近年來,外泌體被認(rèn)為參與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展,特別是與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),且能夠影響癌癥患者的治療效果,通過分析外泌體可以直接獲得癌細(xì)胞的基本信息。乳腺癌是威脅女性健康的主要疾病之一。研究人員發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞釋放的外泌體數(shù)目通常高于正常細(xì)胞的外泌體,因此認(rèn)為其可以作為液體活檢的標(biāo)志物。目前,用于癌癥早期診斷的外泌體中常用的分子標(biāo)志物主要包括蛋白質(zhì)和核酸。電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)具有靈敏度高、可控性好、檢測速度快的優(yōu)點,已成為分析檢測領(lǐng)域的熱門技術(shù)。利用電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)檢測外泌體為外泌體表面蛋白表達(dá)和生理功能的研究提供了有力的工具。本論文利用納米壓印技術(shù)制備了納米溝槽基底以模擬細(xì)胞外基質(zhì),構(gòu)建了基于細(xì)胞交流阻抗技術(shù)的電化學(xué)傳感器,分析了人真皮成纖維細(xì)胞(HFF)和人永生化表皮細(xì)胞(HaCaT)在納米溝槽上的粘附與鋪展行為。此外,合成Ru(bpy)_3~(2+)-SiO_2納米顆粒,并通過結(jié)合核酸適配體構(gòu)建三明治夾心型電化學(xué)發(fā)光傳感器,在定量分析MCF-7乳腺癌細(xì)胞以測試傳感器的性能后,該傳感器用于定量分析乳腺癌細(xì)胞MCF-7來源的外泌體。本論文一共包括四章內(nèi)容,具體如下:第一章緒論本章首先介紹了三維微納米結(jié)構(gòu)的分類和不同表面結(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響,以及細(xì)胞交流阻抗技術(shù)的提出和其在細(xì)胞行為研究中的應(yīng)用。其次,本章介紹了外泌體的形成、分泌與生物學(xué)功能,重點介紹了目前已有的外泌體分離與定量分析技術(shù)。其中,超速離心法為本論文分離外泌體所采用的方法,電化學(xué)發(fā)光技術(shù)為定量方法。接下來,本章描述乳腺癌細(xì)胞和外泌體之間的關(guān)聯(lián)以及乳腺癌的早期診斷。在該章的最后,提出了本論文的研究目的和意義。第二章交流阻抗傳感技術(shù)實時監(jiān)測納米溝槽上皮膚細(xì)胞的定向行為在本章中,納米溝槽通過納米壓印技術(shù)制備,以模擬細(xì)胞外基質(zhì),分析了人真皮成纖維細(xì)胞(HFF)和人永生化表皮細(xì)胞(HaCaT)在納米溝槽上的粘附、鋪展和定向行為,并利用交流阻抗技術(shù)監(jiān)測兩種細(xì)胞在納米溝槽上的粘附和鋪展行為。結(jié)果表明,HFF細(xì)胞首先在納米溝槽上定向排列,然后胞體延長;HaCaT細(xì)胞沒有定向行為,并且它們的粘附和鋪展被延遲。并且,納米溝槽上HFF細(xì)胞產(chǎn)生的交流阻抗信號與比對細(xì)胞的百分比之間存在著良好的線性關(guān)系;而HaCaT細(xì)胞在粘附過程中的交流阻抗信號比鋪展過程中的交流阻抗信號更大。第三章基于Ru(bpy)_3~(2+)-SiO_2 NPs的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測MCF-7細(xì)胞本章使用來自MCF-7細(xì)胞上兩種不同蛋白質(zhì)的核酸適配體構(gòu)建三明治電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器,通過反相微乳法合成SiO_2包裹的Ru(bpy)_3~(2+)納米粒子作為信號分子并放大Ru(bpy)_3~(2+)的信號。該傳感器定量MCF-7細(xì)胞,在3.63×10~4-3.63×10~6個/mL的范圍內(nèi)線性良好,檢測限為4000個/mL。該傳感器制備過程簡單,具有良好的選擇性,有望應(yīng)用于多種不同的生物體系。第四章基于Ru(bpy)_3~(2+)-SiO_2 NPs的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器特異性檢測乳腺癌外泌體本章構(gòu)建了一種基于Ru(bpy)_3~(2+)-SiO_2 NPs的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器,外泌體通過MCF-7乳腺癌細(xì)胞外泌體表面上的MUC1蛋白來特異性定量。該實驗利用MCF-7細(xì)胞外泌體上特異性蛋白CD63和MUC1對應(yīng)的aptamer設(shè)計了三明治夾心結(jié)構(gòu),并制備了核殼結(jié)構(gòu)的Ru(bpy)_3~(2+)-SiO_2 NPs來放大發(fā)光信號。結(jié)果該傳感器分析外泌體具有較寬的檢測范圍,為3.3×10~2-1.6×10~8個/μL,以及低至280個/μL的檢測限。該傳感器可靈活用于不同乳腺癌外泌體的檢測,且靈敏度高,重現(xiàn)性好,為臨床診斷早期乳腺癌提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：O657.1;Q2-33
【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1 三維微納米結(jié)構(gòu)上細(xì)胞行為的交流阻抗分析研究
        1.1 三維微納米結(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響
        1.2 細(xì)胞交流阻抗技術(shù)的原理與應(yīng)用
    2 外泌體的生物學(xué)意義及其分離與檢測
        2.1 外泌體的形成與分泌
        2.2 外泌體的生物學(xué)功能
        2.3 外泌體分離技術(shù)
        2.4 外泌體定量分析技術(shù)
    3 乳腺癌細(xì)胞及外泌體表面蛋白與乳腺癌早期診斷
    4 本論文的目的和意義
    參考文獻(xiàn)
第二章 交流阻抗傳感技術(shù)實時監(jiān)測納米溝槽上皮膚細(xì)胞的定向行為
    1 引言
    2 實驗部分
        2.1 實驗試劑
        2.2 實驗儀器
        2.3 納米溝槽的制備
        2.4 交流阻抗器件的搭建
        2.5 皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.6 皮膚細(xì)胞在納米溝槽上的定向行為分析
        2.7 交流阻抗實時監(jiān)測皮膚細(xì)胞在納米溝槽上的粘附與鋪展
    3 結(jié)果與討論
        3.1 納米溝槽的表征
        3.2 皮膚細(xì)胞在納米溝槽上的定向行為分析
        3.3 交流阻抗特征頻率的選擇
        3.4 交流阻抗實時監(jiān)測皮膚細(xì)胞在納米溝槽上的粘附與鋪展行為
        3.5 交流阻抗信號與定向細(xì)胞百分比的關(guān)聯(lián)
    4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
3
2+-SiO₂ NPs的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測MCF-7細(xì)胞'>第三章 基于Ru（bpy）3
2+-SiO₂ NPs的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測MCF-7細(xì)胞
    1 引言
    2 實驗部分
        2.1 實驗試劑
        2.2 實驗儀器
        2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與提取
        2.4 細(xì)胞適配體傳感器的構(gòu)建
3
2+-SiO₂納米顆粒的合成和Ru（bpy）3
2+-SiO₂-aptamer2探針的制備'>        2.5 Ru（bpy）3
2+-SiO₂納米顆粒的合成和Ru（bpy）3
2+-SiO₂-aptamer2探針的制備
        2.6 電致化學(xué)發(fā)光測定MCF-7細(xì)胞
    3 結(jié)果與討論
3
2+-SiO₂納米粒子的表征'>        3.1 Ru（bpy）3
2+-SiO₂納米粒子的表征
        3.2 實驗條件優(yōu)化
        3.3 MCF-7細(xì)胞的線性檢測
        3.4 MCF-7細(xì)胞傳感器的選擇性
    4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
3
2+-SiO₂ NPs的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器特異性檢測乳腺癌外泌體'>第四章 基于Ru（bpy）3
2+-SiO₂ NPs的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器特異性檢測乳腺癌外泌體
    1 引言
    2 實驗部分
        2.1 實驗試劑
        2.2 實驗儀器
        2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與外泌體的提取
        2.4 外泌體透射電鏡及納米顆粒跟蹤分析（NTA）表征
        2.5 蛋白免疫印跡（WB）表征
3
2+-Si_O2納米顆粒的合成和Ru（bpy）3
2+-SiO₂-MUC1探針的制備'>        2.6 Ru（bpy）3
2+-Si_O2納米顆粒的合成和Ru（bpy）3
2+-SiO₂-MUC1探針的制備
        2.7 電極表面外泌體的捕獲
        2.8 外泌體的電化學(xué)發(fā)光檢測
    3 結(jié)果與討論
        3.1 外泌體的TEM與 NTA表征
        3.2 外泌體蛋白的WB表征
3
2+)-SiO₂納米粒子的性質(zhì)'>        3.3 Ru（bpy）3
2+)-SiO₂納米粒子的性質(zhì)
        3.4 ECL適配體傳感器檢測外泌體的可行性研究
        3.5 實驗條件的優(yōu)化
        3.6 ECL適配體傳感器定量分析MCF-7 細(xì)胞外泌體
        3.7 不同乳腺癌外泌體的檢測與分析
    4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
附錄：碩士期間的科研成果
致謝

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本文編號：2851856

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