發(fā)布時(shí)間：2020-10-21 13:21

　　 微生物天然產(chǎn)物是新藥研發(fā)的重要來源,其中特殊生境微生物在各種環(huán)境脅迫因素的影響下,能產(chǎn)生更多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性獨(dú)特的天然產(chǎn)物。采用基因組導(dǎo)向的天然產(chǎn)物挖掘策略,運(yùn)用基因組學(xué)、生物信息學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)和合成生物學(xué)等多學(xué)科交叉融合手段,對特殊生境微生物進(jìn)行新穎基因的挖掘和新穎天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定,能夠避免大量已知化合物的重復(fù)發(fā)現(xiàn),為天然產(chǎn)物研究提供新的機(jī)遇。本論文對實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的植物病原真菌和海洋放線菌的基因組庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析,通過antiSMASH網(wǎng)站進(jìn)行基因簇預(yù)測和分析,從中選取次級(jí)代謝產(chǎn)物較為豐富的植物病原真菌麥根腐平臍蠕孢菌Bipolaris sp.11134和海洋疣孢菌Verrucosispora sp.MS1003菌作為研究對象,通過單菌多產(chǎn)物策略(OSMAC)激活生物合成基因簇,研究新的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu),并對真菌中倍半萜合酶及其環(huán)化機(jī)制進(jìn)行研究。從麥根腐平臍蠕孢菌Bipolaris sp.11134中分離得到6個(gè)seco-sativene類倍半萜化合物(1-6),其中包括3個(gè)新化合物sesquisorokins A-C(1-3)。Seco-sativene類化合物含有獨(dú)特的雙環(huán)[3.2.1]橋環(huán)結(jié)構(gòu),該類型結(jié)構(gòu)的生物合成機(jī)制尚未報(bào)道。從可能的生物合成機(jī)制分析,發(fā)現(xiàn)其包含罕見的裂環(huán)機(jī)制,因此本論文進(jìn)一步對其關(guān)鍵合酶展開了相關(guān)研究。利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了Bipolaris sp.11134的基因組中含有4個(gè)潛在的倍半萜合酶基因序列,結(jié)合其所在的基因簇深入分析,通過構(gòu)建釀酒酵母、大腸桿菌、構(gòu)巢曲霉三種異源表達(dá)體系對潛在倍半萜合酶進(jìn)行體內(nèi)異源生產(chǎn),鑒定環(huán)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及體外酶學(xué)催化實(shí)驗(yàn)表征倍半萜合酶的功能,并進(jìn)一步結(jié)合已經(jīng)鑒定的倍半萜化合物化學(xué)結(jié)構(gòu),推測其生物合成途徑。此外,比較基因組學(xué)分析顯示,海洋疣孢菌Verrucosispora sp.MS1001 37與能夠產(chǎn)生具有抗MASR活性的abyssomicin類化合物的V.maris AB-18-032含有相同的生物合成基因簇,在進(jìn)行基因簇注釋時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有尚未有功能鑒定的黃素依賴的環(huán)氧化酶,本論文通過OSMAC發(fā)酵和LC-MS實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步挖掘Verrucosispora sp.MS10037的次級(jí)代謝潛力,通過放大發(fā)酵、分離純化共得到7個(gè)化合物(7-13),綜合運(yùn)用高分辨質(zhì)譜、核磁共振和圓二色譜等多種現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù),鑒定為4個(gè)abyssomicin類化合物(7-10)和3個(gè)proximicin類化合物(11-13),其中abyssomicin Y(7)是abyssomicin類化合物結(jié)構(gòu)中C8和C9位上的雙鍵被環(huán)氧基團(tuán)取代的新化合物,進(jìn)一步的基因功能鑒定正在進(jìn)行中。
【學(xué)位單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q936
【部分圖文】：

素（ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ，Ｒ１）?７能夠通過抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌中肽聚糖的生物合成??導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞裂解和死亡８；甘氨酰四環(huán)素類新型抗生素如替加環(huán)素（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ，??Ｒ２）能夠應(yīng)對金黃色葡萄球菌的抗生素耐藥問題９。表１．１和圖１．２列出了目前??經(jīng)ＦＤＡ批準(zhǔn)上市的天然產(chǎn)物來源的部分抗菌藥物。??表１．１天然產(chǎn)物來源的抗菌代表性藥物??Ｔａｂｌｅ?１．１?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ?ｄｍｇｓ?ｄｅｒｉｖｅｄ?ｆｒｏｍ?ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??ａｍ．?化合物名稱?作用?來源?市參考??＾?（英文名，商品名）?＾＾?年代文獻(xiàn)??Ｒ１?ｒ?廣譜抗生素?Ｓ‘?ｆｒａｄｉａｅ?１９９８?７??Ｃ１?ｏｓｉｏｍｙｃｍ？?ＩＶｌｏｎｕｒｉｌ）??替加環(huán)素?金黃色葡萄球?甘氨酰四環(huán)素類衍?９??１?￣?（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ，?Ｔｙｇａｃｉｌ）?菌等耐藥菌株?生物??Ｒ３?非達(dá)霉窄譜抗生素＂轉(zhuǎn)切—膽?２〇１１?１０??（ｆｉｄａｘｏｎｕｃｉｎ，?Ｄｉｆｉｃｉｄ）?ａｕｒａｎｔｉｃｕｍ??Ｒ４?（ｃｅｆｂｔ＾＾ｐｏｎｎ）?＾譜抗生素麵素麵生物ｉ撕??Ｒ５?Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ?ｍｕｔｉｈｉｓ?２００７?１２－１３??（ｒｅｔａｐａｎｉｕｌｉｎ

?Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ?（Ｒ１１）?Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ?（Ｒ１２）?Ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ?（Ｒ１３）??圖１．３天然產(chǎn)物來源的抗腫瘤及抗病毒代表性藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式（Ｒ６－Ｒ１３）??Ｆｉｇ?１．３?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ａｎｔｉｔｕｍｏｒ?ａｎｄ?ａｎｔｉｖｉｒａｌ?ｄｒｕｇｓ?ｄｅｒｉｖｅｄ?ｆｒｏｍｂｙ?ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??（Ｒ６－Ｒ１３）??在眾多的天然產(chǎn)物來源的藥物中，萜類成分的研究是非常活躍的領(lǐng)域，也是??尋找和發(fā)現(xiàn)天然藥物先導(dǎo)性分子以及其它功能分子的重要源泉。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前己??知的萜類化合物的總數(shù)超過８萬種，其代表性明星藥物青蒿素和紫杉醇廣為人知??２３＿２４。青蒿素（ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ，Ｒ１４）是提取自黃花蒿的一種含有過氧橋鍵的倍半萜??內(nèi)脂類化合物，是目前為止見效最快的抗惡性瘧原蟲瘧疾藥物２５。１９６９－１９７２年??間，我國科學(xué)家屠呦呦帶領(lǐng)課題組成員發(fā)現(xiàn)并從黃花蒿中提取了青蒿素２５，并因??此獲得２０１５年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。另一種明星藥物紫杉醇（ｐａｄｉｔａＸｅｌ，Ｒ１６）??被用來治療包括卵巢癌、乳癌、肺癌和胰臟癌在內(nèi)的多種癌癥２６。自１９９２年獲??得ＦＤＡ批準(zhǔn)到２０００年

挖掘借助自動(dòng)化工具進(jìn)行開發(fā)，包括ＢＡＧＥＬ７７、ＣＬＵＳＥＡＮ７８和ａｎｔｉＳＭＡＳＨ７９等??工具的出現(xiàn)，極大地加速了研宄人員的進(jìn)展。??圖１．８和表１．４列舉了部分通過基因組挖掘發(fā)現(xiàn)的新天然產(chǎn)物，如Ｃｈａｌｌｉｓ等??人在天藍(lán)色鏈霉菌Ｘ?ｃｏｅ／／ｃｏ／ｏｒ中通過基因組挖掘非核糖體肽合成酶（ＮＲＰＳ）基??因簇發(fā)現(xiàn)的新肽類天然產(chǎn)物ｃｏｅｌｉｃｈｅｌｉｎ?（Ｒ２４）?８Ｇ；?Ｇｅｒｗｉｃｋ團(tuán)隊(duì)利用基因組挖掘??方法分析熒光假單胞菌Ｐｆ－５的全基因組序列得到新的脂肽類化合物Ｏｒｆａｍｉｄｅ?Ａ??（Ｒ２５）８１；?Ｏｎａｋａ等人使用基因組挖掘的方法，用強(qiáng)啟動(dòng)子替換內(nèi)源性啟動(dòng)子從??而將ｌａｃｔａｚｏｌｅ?Ａ?（Ｒ２６）的產(chǎn)量提高３０倍８２；?Ｍａｔｓｕｄａ團(tuán)隊(duì)從生物信息學(xué)角度出??發(fā)挖掘結(jié)類合酶發(fā)現(xiàn)二砲新化合物ｓｔｅｌｌａｔｉｃ?ａｃｉｄ?（Ｒ２７）?Ｓ３。??ｉｉ??
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本文編號(hào)：2850167