葡萄糖氧化酶(GOX)已廣泛應(yīng)用。目前,除了曲霉和青霉屬來(lái)源的GOX外,很少有新型GOX被報(bào)道。本研究采用平板顯色的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的真菌進(jìn)行產(chǎn)GOX的篩選,耐寒枝孢菌Cladosporium neopsychrotolerans SL16表達(dá)了GOX活性。根據(jù)其基因組測(cè)序數(shù)據(jù),克隆了GOX編碼基因CngoxA。另外,根據(jù)GOX序列相似性,從枝孢菌C.tianshanense SL19和一株黑曲霉Aspergillus niger MJ5中克隆得到5個(gè)可能的GOX基因,分別為CngoxB、AngoxA5、AngoxA7、AngoxA8和AngoxA3。CngoxA和CngoxB編碼的蛋白與已報(bào)道驗(yàn)證功能的GOX最高一致性為35%,兩者間一致性為80%,均為新穎的GOX。AngoxA5編碼的蛋白與已驗(yàn)證功能的GOX最高一致性為97%,而AngoxA7、AngoxA8和AngoxA3編碼的蛋白與已報(bào)到GOX序列相似性約為50-68%。6個(gè)基因在畢赤酵母Pichia pastoris中進(jìn)行表達(dá),只有CngoxA和AngoxA5表達(dá)了具有葡萄糖氧化酶活性的蛋白。來(lái)源于C.neopsychrotolerans SL16的CnGOXA在20℃和pH 7.0的條件下具有最高活性,在0℃時(shí)依然具有75%的酶活力,屬于低溫酶,在40℃時(shí)的半衰期為15 min,在pH 6.0–9.0條件下穩(wěn)定。CnGOXA比活力為90 U·mg~(-1),K_m和V_(max)分別是103 mM和90.1μmol·min~(-1)·mg~(-1)。CnGOXA對(duì)SDS具有較強(qiáng)抗性,5 mM和10 mM的SDS對(duì)其酶活力均無(wú)影響。重組的AnGOXA5的性質(zhì)與A.niger來(lái)源的GOX(1CF3)性質(zhì)相似。經(jīng)過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)C.tianshanense SL19來(lái)源的CnGOXB C端較CnGOXA短,將CngoxA中對(duì)應(yīng)的核酸序列拼接到CngoxB中獲得了CngoxB-m1,并成功在畢赤酵母中表達(dá),比活為123.8 U·mg~(-1),高于CnGOXA。為了提高CnGOXA的穩(wěn)定性和催化活性,我們對(duì)CnGOXA進(jìn)行了突變研究。在CnGOXA的Y169和A211位點(diǎn)引入二硫鍵(Y169C-A211C),構(gòu)建了突變體CnGOXA-M1。畢赤酵母中表達(dá)的CnGOXA-M1的最適pH與CnGOXA一致,而最適溫度為25℃,較CnGOXA提高了5℃,其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性有了大幅提升,在40°C時(shí)的半衰期較野生型提高了48倍(720 min vs.15min),pH穩(wěn)定范圍由pH 6.0–9.0擴(kuò)大到pH 3.0–12.0,比活為123.8U·mg~(-1),較CnGOXA提高了37%。在CnGOXA-M1基礎(chǔ)上,通過(guò)引入pi-pi鍵、氫鍵作用網(wǎng)絡(luò)、鹽橋以及表面電荷相互作用構(gòu)建了T525H、G147R、E74K、E150K和E476K位點(diǎn)突變體,它們的熱穩(wěn)定性與CnGOXA-M1相比均提高。將5個(gè)位點(diǎn)組合獲得了突變體CnGOXA-M2,相比于CnGOXA-M1,其在50℃處理1 h后剩余酶活力提高了約200倍(79.8%vs.0.4%),比活為166.2 U·mg~(-1),提高了34%。面包烘焙實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CnGOXA-M1和A.niger來(lái)源GOX在面粉中的最佳添加量分別為6和4 U·kg~(-1),對(duì)應(yīng)面包的體積與質(zhì)量比分別為6.4和6.2 cm~3·g~(-1),相比于未添加酶的空白對(duì)照組(5.9 cm~3·g~(-1)),均有效地促進(jìn)了面包體積增加,而CnGOXA-M1效果更佳。本研究克隆了6個(gè)葡萄糖氧化酶基因,其中3個(gè)基因在畢赤酵母中成功進(jìn)行表達(dá)并檢測(cè)到了GOX活性。對(duì)CnGOXA進(jìn)行了突變研究,有效提高了其熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和催化活性。CnGOXA-M1在面包烘焙實(shí)驗(yàn)中可有效促進(jìn)面包體積增加。另外,CnGOXA-M1、M2在低溫、中堿性條件下酶活力高以及抗SDS的特性使其在洗滌及水產(chǎn)飼料添加劑工業(yè)中具有應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;Q55
【部分圖文】：

第一章 引 言1 葡萄糖氧化酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理.1 葡萄糖氧化酶的結(jié)構(gòu)葡萄糖氧化酶(GOX, EC1.1.3.4)是一種黃素依賴型蛋白，屬于葡萄糖/甲醇/膽堿氧化還原。目前，黑曲霉（Aspergillus niger）和尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)來(lái)源的 GOX 晶得到了報(bào)道（PDB code: 1CF3、3QVP、5NIT、5NIW 和 1GPE 等）。從晶體結(jié)構(gòu)中可以看出A），GOX 以同源二聚體的形式存在，分子量約為 160 kDa。每個(gè)亞基非共價(jià)結(jié)合一個(gè) FA，而兩個(gè)亞基通過(guò)鹽橋和氫鍵等作用力作用接觸在一起。GOX 單亞基晶體結(jié)構(gòu)中已鑒定 N-糖基化修飾位點(diǎn)，在 A. niger 來(lái)源的 GOX 中分別為 Asn89，Asn161，Asn355 和 Asn388 (Kal., 1991)。在 Asn89 處形成的糖鏈間相互作用進(jìn)一步穩(wěn)定了二聚體，而且該糖鏈與一個(gè) 構(gòu)(75 至 98 位氨基酸殘基)共同組成了催化入口處的蓋子結(jié)構(gòu)(Wohlfahrt et al., 1999)。目前底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)尚未得到報(bào)道。從同源建模推導(dǎo)的結(jié)果來(lái)看，在 GOX 結(jié)構(gòu)中 Tyr6n514，Arg512，His516，His559 和 Thr / Ser110 可以與底物相互作用，其中 His516 和 Hi能發(fā)揮著催化底物的作用(Witt et al., 1998; Petrovic et al., 2017)（圖 1.1B）。

X 催化葡萄糖生成葡萄糖內(nèi)酯的反應(yīng)機(jī)理 B. GOX 的催2017）nism of GOX. A. The reaction mechanism of GOX catalyzinB. The catalytic center structure of GOX來(lái)源、基因克隆與表達(dá)X 是來(lái)源于曲霉和青霉屬。目前已在黑曲霉（A. nitteveen et al., 1990)，土曲霉（A. terreus）(Ah013)，米曲霉（A. oryzae）(Gunasundari, 2014)，炭霉（A. tubingensis）(M. Kriaa et al., 2016)等曲agasakiense）(Guido et al., 2015)，嗜松青霉（Panescens）(Simpson, 2005)，癭青霉（P. fellutanuetzii）(Mikhailova et al., 2007)，變幻青霉（P. var

位論文 第二章 葡萄糖氧化酶基溫度，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下測(cè)定葡萄糖氧化酶的酶活，繪制最適溫度段時(shí)間，然后在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下測(cè)定酶活，計(jì)算相對(duì)酶活力，繪酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定底物（20–1,600 mM），在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，測(cè)定葡萄糖氧化酶件繪制酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算 Km和 Vmax值。化酶菌株的篩選結(jié)果在 MB 固體平板菌落上覆蓋葡萄糖氧化酶活性驗(yàn)證液過(guò)夜 25 chrotolerans SL16)菌落周圍呈現(xiàn)深褐色，因此該菌株作為了后續(xù)菌 SL16 親緣關(guān)系較近的枝胞菌 SL19 (C. tianshanense SL19)菌落這一現(xiàn)象后續(xù)我們也進(jìn)行基因克隆研究。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡紅偉;麻嘯濤;閆凌鵬;陳茹茹;任帥;楊京娥;;葡萄糖氧化酶的研究進(jìn)展及其在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用分析[J];飼料博覽;2019年07期

2 胡成;李寧寧;劉則學(xué);;葡萄糖氧化酶在生豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J];廣東飼料;2018年08期

3 朱運(yùn)平;褚文丹;李秀婷;劉瑞山;孫寶國(guó);滕超;伍少明;;1株產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶黑曲霉的液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J];中國(guó)食品學(xué)報(bào);2014年05期

4 魯春剛;;葡萄糖氧化酶在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];飼料廣角;2013年15期

5 殷驥;梅寧安;;日糧中添加飼用葡萄糖氧化酶對(duì)肉仔豬生長(zhǎng)性能的影響[J];當(dāng)代畜牧;2012年02期

6 趙慧秋;趙國(guó)先;張曉云;馬可為;張振紅;;葡萄糖氧化酶及其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];河南畜牧獸醫(yī)(綜合版);2007年09期

7 張寧,袁平宗,史德,李傳達(dá),陳秀珍,殷運(yùn)忠;葡萄糖氧化酶—氧消耗速率法的方法學(xué)評(píng)價(jià)[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年04期

8 王樹(shù)慶;劉秀華;劉新華;;葡萄糖氧化酶及其在食品工業(yè)上的應(yīng)用[J];山東食品發(fā)酵;2000年01期

9 方炎,胡風(fēng)霞,劉炳玉,林書(shū)煌;葡萄糖氧化酶結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[J];光電子·激光;1998年03期

10 楊惠英,李弘毅,劉建忠,魯統(tǒng)部,計(jì)亮年;黑曲霉中提取葡萄糖氧化酶的探索 Ⅰ.葡萄糖氧化酶合成及其性質(zhì)[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1998年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張素霞;葡萄糖氧化酶穩(wěn)定有序多層（或單層）膜電極的研究[D];吉林大學(xué);2005年

2 孫瑩瑩;葡萄糖氧化酶/納米材料單層或多層膜用于構(gòu)筑葡萄糖生物傳感器[D];吉林大學(xué);2008年

3 高玉舟;雙酶體系的構(gòu)建及其應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2013年

4 楊光;微納電化學(xué)葡萄糖生物傳感器的分子動(dòng)力學(xué)模擬研究[D];浙江大學(xué);2017年

5 馬國(guó)仙;生物燃料電池中酶和蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

6 王霞;微膠囊化葡萄糖氧化酶的制備及對(duì)小麥粉品質(zhì)的改良研究[D];江南大學(xué);2011年

7 衛(wèi)銀銀;新型葡萄糖生物傳感器的構(gòu)筑、機(jī)理及應(yīng)用研究[D];華東師范大學(xué);2011年

8 宋永貴;基于電化學(xué)傳感與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的生物活性物質(zhì)體內(nèi)分析研究[D];江西師范大學(xué);2017年

9 許小青;化學(xué)小分子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)活性中心周圍微環(huán)境的變化[D];南京師范大學(xué);2016年

10 吳峰;基于石墨烯、貴金屬及其復(fù)合材料的小分子電分析和電催化研究[D];湖南師范大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 葛建忠;新型葡萄糖氧化酶的基因克隆、表達(dá)和性質(zhì)改良[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 鄭玲燕;葡萄糖氧化酶介導(dǎo)的等離子共振ELISA檢測(cè)玉米中的伏馬毒素B_1[D];南昌大學(xué);2017年

3 石義超;葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)研究[D];西南大學(xué);2018年

4 閆嘵華;膠束納米粒子在氧化酶類生物催化體系中的分析應(yīng)用研究[D];河北大學(xué);2018年

5 黃毅;高產(chǎn)葡萄糖氧化酶分泌型基因工程菌的構(gòu)建[D];北京化工大學(xué);2018年

6 龍靜;微波信號(hào)的生物傳感研究[D];武漢理工大學(xué);2017年

7 付長(zhǎng)濤;發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖氧化酶[D];北京化工大學(xué);2017年

8 趙勇;基于理性設(shè)計(jì)的葡萄糖氧化酶性質(zhì)改良[D];湖北大學(xué);2015年

9 張慧萍;葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的高表達(dá)及其酶電極的制備[D];中南民族大學(xué);2018年

10 羅時(shí)渝;葡萄糖氧化酶在無(wú)孢黑曲霉中的高效重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[D];華南理工大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2850325