谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,glnA)對(duì)銨有很好的吸收作用,能有效降解水質(zhì)中的部分有害氨氮物質(zhì)。氮代謝全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Global nitrogen regulator,glnR)是一類氮源敏感調(diào)節(jié)因子,可以抑制或激活氮代謝相關(guān)基因的表達(dá),從而吸收氮源。本試驗(yàn)用PCR、RT-PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的glnA、glnR基因及并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)glnA、glnR對(duì)氨態(tài)氮((NH_4)_2SO_4)的應(yīng)答。對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體進(jìn)行蛋白表達(dá)及鑒定,進(jìn)而初步探究glnA、glnR蛋白功能。獲得主要結(jié)果如下:本試驗(yàn)克隆出枯草芽孢桿菌glnA基因CDS序列1335 bp,可編碼444個(gè)氨基酸,glnA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋(42.57%),自由卷曲(34.46%)組成。glnA是穩(wěn)定蛋白,是谷氨酰胺合成酶超家族成員。glnR基因CDS序列408 bp,編碼135個(gè)氨基酸,glnR蛋白主要由α螺旋(54.07%),自由卷曲(36.30%)組成。glnR為不穩(wěn)定蛋白,是Mer超家族成員。STRING預(yù)測(cè)表明:glnA蛋白與nasB、nasD、nasE、glnR等蛋白存在互作關(guān)系;glnR蛋白與glnA、amtB、gltA等蛋白存在互作關(guān)系。用qRT-PCR檢測(cè)glnA、glnR基因?qū)Π钡膽?yīng)答,在24 h時(shí)glnA基因在40 mM、50 mM、100 mM和125 mM(NH_4)_2SO_4處理的枯草芽孢桿菌樣品中的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于未加(NH_4)_2SO_4的枯草芽孢桿菌對(duì)照組樣品(p0.01),其中在125 mM相對(duì)表達(dá)量最高,極顯著高于40 mM和100mM(NH_4)_2SO_4處理組(p0.01)。glnR基因在100 mM、125 mM(NH_4)_2SO_4處理枯草芽孢桿菌樣品中相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于未加(NH_4)_2SO_4的枯草芽孢桿菌對(duì)照組(p0.01),其中在125 mM相對(duì)表達(dá)量最高,極顯著高于20 mM、40 mM、50 mM和100 mM處理組(p0.01)。glnA、glnR基因表達(dá)量在一定范圍內(nèi)與氨氮濃度的變化呈正相關(guān)。SDS-PAGE結(jié)果顯示glnA蛋白大小約為50 kDa,glnR蛋白大小約14 kDa。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,glnA蛋白肽段可信度得分最高,為544.1,蛋白質(zhì)覆蓋率為88%,平均分子質(zhì)量約為50.25 kDa,鑒定為glnA蛋白。glnR蛋白肽段可信度得分最高,為412.12,蛋白質(zhì)覆蓋率為97%,平均分子質(zhì)量約為14.87 kDa,鑒定為glnR蛋白。對(duì)誘導(dǎo)的蛋白進(jìn)行純化和復(fù)性,并將純化復(fù)性蛋白添加到養(yǎng)殖水質(zhì)中,glnA蛋白(19μg/mL)在4 h后將水中氨氮含量從0.8 mg/L降解至0.01 mg/L。glnR蛋白(2.72μg/mL)在4 h后將養(yǎng)殖水質(zhì)氨氮含量從0.8mg/L降解至0.01 mg/L。glnA、glnR蛋白對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)的氨氮含量有較明顯的降解作用。毒力試驗(yàn)表明glnA、glnR蛋白表達(dá)對(duì)大腸桿菌有一定的抑制作用。以上結(jié)果表明glnA、glnR基因在氨氮降解中具有一定的作用,這為進(jìn)一步研究glnA、glnR功能提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q933
【部分圖文】：

GS Ⅱ，GS Ⅲ[12,13]。現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道 GS Ⅱ菌中主要有 GSⅠ，GSⅢ，[2,12-16]。大多數(shù)菌僅有一種 基因編碼，原核生物 GS Ⅰ由 12 個(gè)相同的約 50 kDa 亞與 glnRA 操縱子緊密相關(guān)[18]。調(diào)控蛋白（Global nitrogen regulator，glnR）是一類廣泛存在革蘭氏陽(yáng)性菌中[19]。glnR 既有 MerR 家族，孢桿菌中的 glnR 蛋白屬于 MerR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族，M-端翼狀的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA連接結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C應(yīng)可利用氮源的變化，glnR 可正向或負(fù)向調(diào)節(jié)氮代謝可以在氮源過(guò)剩時(shí)抑制 glnRA 操縱子的表達(dá)，作為 g]。lnR 的結(jié)構(gòu)

形成的共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái)[2,17]。GS Ⅰ存在 γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移活性，均需要二價(jià)金屬離子作為輔助因子完成催化反應(yīng)，如：Mn2+，MlnR 調(diào)控因子由 glnR 基因編碼， glnR 位于 glnA 上游，是雙順販子子的一個(gè)部分。glnR 調(diào)控因子作為 MerR 家族的成員，含有保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 DNA 結(jié)構(gòu)域和 C-端信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域[9]，并形成二聚nRA 操縱子的 glnRA01 和 glnRA02 操作子上，在氮源豐富時(shí)抑制 gln8]。lnA 和 glnR 的催化機(jī)理GS I 型的十二聚體結(jié)構(gòu)露出一些具有重要功能的環(huán)，環(huán)突出到十二通道中，且是蛋白水解的位點(diǎn)和 ADP 核糖基化位點(diǎn)。圖 1-2 顯示這色中央通道的新月形脊分子，也是孤立在右邊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的亞基上。

枯草芽孢桿菌 glnA 和 glnR 基因的鑒定及其對(duì)氨氮的應(yīng)答析 glnR 基因擴(kuò)增及克隆基因得到 420 bp 左右條帶，條帶清晰，與預(yù)期片段glnA 基因擴(kuò)增得到 1350 bp 左右，條帶清晰單一，結(jié)
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本文編號(hào)：2842100