發(fā)布時(shí)間：2020-10-11 01:40

　　 Henry反應(yīng)是有機(jī)反應(yīng)中形成C-C鍵的重要反應(yīng),該反應(yīng)以硝基烷烴與醛或酮類為底物生成β-硝基醇類化合物。使用金屬絡(luò)合物等化學(xué)催化劑催化Henry反應(yīng)存在反應(yīng)條件苛刻、副反應(yīng)多,污染大等弊端。而利用脂肪酶的催化功能多樣性進(jìn)行酶促Henry反應(yīng)可以有效解決上述問題。目前,已發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種脂肪酶具有催化Henry反應(yīng)的能力,但反應(yīng)活性及選擇性均較差,且沒有關(guān)于酶結(jié)構(gòu)改造及催化機(jī)理解析的報(bào)道。因此本文對脂肪酶催化的Henry反應(yīng)進(jìn)行研究,從酶的篩選、純酶的表達(dá)、催化機(jī)理的解析以及化學(xué)修飾改造等方面展開。首先,以苯甲醛與硝基甲烷為模式反應(yīng),對一系列常見的商品化脂肪酶進(jìn)行篩選,獲得反應(yīng)活性較優(yōu)的脂肪酶RNL,其在純水體系中的產(chǎn)品產(chǎn)率為36.10%。對RNL進(jìn)行蛋白電泳后發(fā)現(xiàn),其目標(biāo)蛋白純度較低,雜蛋白含量多。因此選擇畢赤酵母GS115作為載體,進(jìn)行表達(dá)純化。收獲純酶后,繼續(xù)對該酶的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究:RNL的最適溫度為40℃,最適pH為8.0,在45℃環(huán)境中放置2 h后殘余酶活仍達(dá)70%以上。接著,對RNL催化Henry反應(yīng)的催化機(jī)理進(jìn)行探究。首先,借助分子對接,發(fā)現(xiàn)活性中心附近10 A范圍內(nèi)存在五個(gè)氨基酸殘基:Ser81、Phe82、Ile86、Ser145以及His257,可能參與了反應(yīng)。隨后,借助分子動(dòng)力學(xué)模擬,對這些氨基酸位點(diǎn)在反應(yīng)中的作用進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)催化三聯(lián)體中的Ser145及His257通過與底物形成氫鍵,起到質(zhì)子傳遞作用,是影響反應(yīng)活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。Ser81、Phe82、Ile86通過與兩底物形成弱鍵作用力,對底物進(jìn)行“錨定”。并以此模擬結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行單點(diǎn)突變驗(yàn)證,對脂肪酶催化Henry反應(yīng)的催化機(jī)理進(jìn)行了初步解析。最后,為了進(jìn)一步提高RNL的反應(yīng)活性,使用化學(xué)修飾法對RNL酶的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。結(jié)果表明,當(dāng)RNL上的Arg殘基被1,2-環(huán)己二酮(CHD)修飾后,產(chǎn)品產(chǎn)率提高1.4倍。接著通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,得到了較優(yōu)的反應(yīng)條件:苯甲醛0.1 mmol;硝基甲烷2.5 mmol;pH 7.5磷酸緩沖液1 mL;RNL(CHD)修飾酶10 mg;35℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h,使產(chǎn)品產(chǎn)率進(jìn)一步由48.15%提升至66.70%。隨后,對該反應(yīng)適用的底物范圍進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)RNL可催化一系列芳香醛與硝基烷烴發(fā)生反應(yīng),且均取得較好的收率,其中以對硝基苯甲醛為底物時(shí)產(chǎn)率最高,達(dá)99.43%。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【部分圖文】：

？〇２?９?ｂａｓｅ?２??＋?ｈ＾Ｒ３?＾＾?Ｒ３??Ｎ〇２??圖１．２?Ｈｅｎｒｙ反應(yīng)??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??Ｐ－硝基醇在有機(jī)合成中可被用于合成許多關(guān)鍵中間體，如：硝基烯烴，２－氨??基醇，２－硝基酮和諸多具備生物活性的化合物。同時(shí)其也被廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)??中，是許多活性藥物，如鞘氨醇和麻黃堿的成分。??２??

圖１．２?Ｈｅｎｒｙ反應(yīng)??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??

圖１．３?Ｈｅｎｒｙ反應(yīng)的綜合應(yīng)用１９］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｕｔｉｌｉｔｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ１９１??目前對于Ｈｅｎｒｙ反應(yīng)的化學(xué)催化機(jī)理，已經(jīng)研究得較為透徹。如圖１．４，在反??應(yīng)過程中，底物硝基烷烴上的ａ－碳原子在堿的作用下去質(zhì)子化，生成碳負(fù)離子。??后者進(jìn)攻醛類物質(zhì)羰基上的碳原子，親核加成，最終得到產(chǎn)物Ｐ－硝基醇。??Ｑ??／￣＼?廣??／?＼?Ｄｃｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ?（??Ｒ?Ｒ２＾ｎｏ２??Ｒ２?Ｎ〇２??Ｎｉｔｒｉｌｅ?ｅｓｔｅｒ??ＯＨ?／?＼??Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ?ｂｏｎｕｓ?Ｎ０２?＋?／?＼??Ｒ?Ｒ＊?Ｉ?Ｈ??ｒ２??圖１．４?Ｈｅｎｒｙ反應(yīng)化學(xué)催化機(jī)理??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??３??
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本文編號(hào)：2835859