α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC.3.1.20)又叫α-D-葡萄糖苷水解酶,可從寡糖底物非還原端切開(kāi)α-1,4糖苷鍵,將釋放的葡萄糖單元以α-1,6鍵轉(zhuǎn)移到麥芽三糖、麥芽糖或葡萄糖等分子上,獲得異麥芽三糖、潘糖、異麥芽糖等低聚糖產(chǎn)物。它存在于自然界中,種類繁多,性質(zhì)各異。目前,α-葡萄糖苷酶已廣泛應(yīng)用于低聚異麥芽糖生產(chǎn)、代謝生理研究、疾病預(yù)防治療等各個(gè)領(lǐng)域。本研究從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得轉(zhuǎn)苷能力強(qiáng)而水解能力弱的構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans,A.nidulans)α-葡萄糖苷酶。將A.nidulans來(lái)源α-葡萄糖苷酶基因AgdB連接到表達(dá)載體pPIC9K上,于Pichia pastoris KM71中表達(dá),同時(shí)共表達(dá)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶,對(duì)重組菌株在3.6 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化,并研究重組α-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在合成低聚異麥芽糖和提高焦糊精中抗性含量的應(yīng)用工藝。主要研究結(jié)果如下:(1)針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷和水解能力特性,比較不同α-葡萄糖苷酶的遺傳進(jìn)化分類特性和三維結(jié)構(gòu)特征結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,預(yù)測(cè)A.nidulans來(lái)源的α-葡萄糖苷酶(氨基酸序列GenBank:BAB39856.1)可能具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)苷能力和較弱的水解能力的特點(diǎn)。根據(jù)NCBI已報(bào)道A.nidulansα-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后合成目的基因AgdB,并構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-AgdB,整合到P.pastoris KM71中成功表達(dá)。(2)為提高目的蛋白的表達(dá)量和酶活,共表達(dá)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶Mpr1,以構(gòu)建重組菌株P(guān).pastoris KM71/pPIC9K–AgdB/pPICZ A–Mpr1,將該重組菌進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵,酶活達(dá)到22.56 U?mL~(-1),是未共表達(dá)Mpr1菌株的1.92倍。對(duì)該菌株進(jìn)行3.6 L罐發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化,結(jié)果表明:當(dāng)誘導(dǎo)溫度25°C,誘導(dǎo)階段甲醇濃度為1%時(shí),酶活最高達(dá)到128.12U?mL~(-1),是搖瓶酶活的5.68倍。(3)對(duì)重組α-葡萄糖苷酶進(jìn)行蛋白分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)分析。研究結(jié)果表明,重組α-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)pH為5.5,最適反應(yīng)溫度為45°C,該重組酶在pH 3.5-8.0較穩(wěn)定,在50°C下半衰期為24 h。重組A.nidulansα-葡萄糖苷酶對(duì)麥芽糖和麥芽三糖轉(zhuǎn)苷動(dòng)力學(xué)參數(shù)K_m值分別為1.78 mM和2.09 mM,其對(duì)麥芽糖、麥芽三糖親和力分別是黑曲霉(Aspergillus niger,A.niger)α-葡萄糖苷酶的10.42和1.56倍。重組A.nidulanα-葡萄糖苷酶對(duì)麥芽糖、麥芽三糖的水解動(dòng)力學(xué)參數(shù)K_m為2.91 mM和5.39 mM,A.nigerα-葡萄糖苷酶對(duì)麥芽糖、麥芽三糖水解親和力是A.nidulansα-葡萄糖苷酶的5.49和7.19倍,結(jié)果表明A.nidulansα-葡萄糖苷酶具有轉(zhuǎn)苷能力強(qiáng)而水解能力弱的特點(diǎn)。(4)優(yōu)化A.nidulansα-葡萄糖苷酶制備低聚異麥芽糖的工藝。以30%麥芽糖為底物制備低聚異麥芽糖的最優(yōu)條件為:pH 5.5,45°C,α-葡萄糖苷酶加酶量為5.1 U·g~(-1)麥芽糖,低聚異麥芽糖產(chǎn)量能達(dá)到最大值216.36 g·L~(-1),轉(zhuǎn)化率為72.12%,是目前報(bào)道的以麥芽糖為底物合成低聚異麥芽糖的最高水平。以焦糊精為底物提高抗性含量的工藝進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后的條件為:pH 5.5,45°C,加酶量2.75 U·g~(-1)焦糊精,反應(yīng)6 h后可以使焦糊精中抗性含量由44.10%提高至63.10%。對(duì)Thermuobifida fusca來(lái)源的分支酶(TfSBE)、Bacillus stearothermophilus來(lái)源的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶(CGTase)和重組α-葡萄糖苷酶復(fù)配進(jìn)一步提高焦糊精抗性含量的工藝進(jìn)行研究,優(yōu)化后條件為:在20%(w·v~(-1))焦糊精底物濃度下,首先反應(yīng)條件調(diào)控在40°C,pH 6.5,TfSBE加酶量1500 U·g~(-1)焦糊精,反應(yīng)12小時(shí)后,重新調(diào)整pH至5.5,同時(shí)加入5 U·g~(-1)焦糊精的α-葡萄糖苷酶和CGTase,在45°C下反應(yīng)12 h,焦糊精的抗性含量由原先的44.10%提高至70.44%。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

圖 1-1 G13 α-葡萄糖苷酶 HaG 的三級(jí)結(jié)構(gòu)(PDB,3WY4). 1-1 Three-dimensional structure of a GH31AGase：HaG (PD-葡萄糖苷酶參與許多重要生理代謝過(guò)程 G31 α-葡構(gòu)域組成，包括 N 端結(jié)構(gòu)域，(β/α)8-桶狀催化結(jié)構(gòu)試劑和酸堿催化劑分別位于 β-折疊片 4 和 6 的末結(jié)構(gòu)也會(huì)參與底物結(jié)合過(guò)程，如圖 1-2 苷酶顯示出不同的底物選擇性，但通常都具有 α-1化酶(MGAM)和蔗糖-異麥芽糖酶(SI)都屬于 G31 α-兩個(gè)催化亞基：N 末端亞基(NtSI 和 NtMGAM)和 C NtSI 具有 Trp327，這個(gè) Trp 殘基是被認(rèn)為是賦予 N有實(shí)驗(yàn)表明，用 Trp 殘基取代 CtMGAM 的 Tyr12異麥芽糖水解的 kcat/Km值[19] 定點(diǎn)誘變研究顯示 Trp169 對(duì) α-1,6 糖苷鍵特異性

圖 1-2 G31α-葡萄糖苷酶 NtMGAM 的三級(jí)結(jié)構(gòu)(PDB,2QMJ)[15]g. 1-2 Three-dimensional structure of a GH31AGase：NtMGAM (PDB,2Q酶發(fā)生酶促反應(yīng)時(shí)，能夠水解底物麥芽糖生成葡萄糖，得到子可以發(fā)生分子內(nèi)轉(zhuǎn)移生成異麥芽糖[22] α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷形選擇性很高的反應(yīng)過(guò)程，麥芽糖水解后的游離葡萄糖經(jīng) α-葡萄異麥芽糖分子[23]，通過(guò) α-1,6 鍵的形式生成潘糖和異麥芽三糖

(c)圖 1-3 麥芽糖生成異麥芽糖 潘糖 異麥芽三糖的反應(yīng)機(jī)制Fig. 1-3 Reaction mechanism of (a) isomaltose (b) panose and (c) isomaltotriose with maltose assubstrate1.1.3 α-葡萄糖苷酶的應(yīng)用α-葡萄糖苷酶在生產(chǎn)低聚異麥芽糖 制備抗性糊精等工業(yè)中具有重要作用[24] 低聚異麥芽糖又稱分支低聚糖，是以淀粉為原料經(jīng)酶糊化后采用 α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷反應(yīng)生產(chǎn)的功能性低聚糖，主要成分是由 2-10 個(gè)葡萄糖殘基組成的至少含有一個(gè) α-1,6 鍵而其他為 α-1,4 鍵的分支糖[25] 市場(chǎng)上的低聚異麥芽糖主要成分包括異麥芽糖 潘糖 異麥芽三糖及四糖以上的具有功能性的分支糖漿，主要分為 IMOs50 型和 IMOs90 型，前者要求低聚糖含量占總糖的 50%以上，而后者則要求 90%以上 低聚異麥芽糖具有許多功能優(yōu)點(diǎn)，如：(1)甜度較低，僅為蔗糖的 40%-50%，且能量也僅為蔗糖的 12.67%，可以作為低熱量低甜度的甜味劑；(2)物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫，耐酸堿，且具有一定黏度，易于食品的加工塑性；(3)具有良好的吸水性，可以保持食品的濕度；(4)添加至食品中
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本文編號(hào)：2836203