鉀離子(K+)通道控制鉀離子流出和流入細(xì)胞的運(yùn)輸,可分為電壓門控鉀通道(Kv)、內(nèi)向整流鉀通道(Kir)、鈣激活鉀通道(KCa)和雙孔鉀通道(K2p)四類。電壓門控鉀通道,有78個(gè)成員,由約40個(gè)基因組成的大家族,分為12個(gè)亞家族(Kv 1-Kv 12)。Kv 7家族,又稱KCNQ家族,包含5個(gè)α亞基,Kv 7.1-7.5,由基因KCNQ 1-5編碼,在不同的組織中具有功能差異性表達(dá),是具有吸引力的藥物靶點(diǎn)。Navβ亞基(Navβ1-Navβ4)是多功能I型跨膜蛋白,調(diào)節(jié)Navα亞基的門控,定位和轉(zhuǎn)運(yùn)。Navβ1亞基也被證實(shí)可以調(diào)節(jié)部分Kv通道的功能,但其亞型選擇性及分子互作機(jī)制不明,Navβ1亞基對KCNQ通道功能調(diào)節(jié)更鮮有報(bào)道。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是一種三維大分子網(wǎng)絡(luò),由結(jié)構(gòu)蛋白,粘連蛋白和一些蛋白聚糖夠成。Tenascins是Tenascin-C(TNC)、Tenascin-R(TNR)等6個(gè)成員組成的一組細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,其中TNC、TNR在細(xì)胞增殖和遷移、軸突病理發(fā)現(xiàn)、髓鞘化、突觸可塑性等方面發(fā)揮重要作用。KCNQ鉀通道與胞外基質(zhì)(TNC、TNR)在細(xì)胞增殖、分化和存活中都具有重要生理作用,那么細(xì)胞膜上KCNQ鉀通道功能是否會受到胞外基質(zhì)TNC/TNR影響?目前關(guān)于胞外基質(zhì)調(diào)控鉀通道的文獻(xiàn),鮮有報(bào)道。因此,本論文旨在探明KCNQ鉀通道、h Navβ1亞基以及胞外基質(zhì)(TNC、TNR)的分子互作組合調(diào)控機(jī)制,以期為臨床相關(guān)疾病的預(yù)防和及新型KCNQ通道靶向治療提供新的策略。本論文通過HEK 293 T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)染KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ4,共同轉(zhuǎn)染KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1、KCNQ4+h Navβ1以及轉(zhuǎn)染后孵育TNC/TNR,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)深入研究KCNQ+h Navβ1、KCNQ-TNC/TNR、KCNQ+h Navβ1-TNC/TNR的電流表達(dá)變化,探究KCNQ鉀通道、h Navβ1亞基以及TNC/TNR的相關(guān)分子互作組合調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下:KCNQ通道門控動力學(xué)的研究,對明確KCNQ通道的電生理特性以及研究h Navβ1亞基與胞外基質(zhì)(TNC、TNR)對KCNQ通道的作用提供參考。在全細(xì)胞膜片鉗模式下,分別記錄HEK 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ4的電流,分析峰值電流、I-V曲線、Id曲線。結(jié)果顯示:KCNQ 1峰值電流約為400±50 p A,電流密度約為70±5 p A/p F;KCNQ 2峰值電流約為350±50 p A,電流密度約為20±5 p A/p F;KCNQ 3峰值電約為600±50 p A,電流密度約為20±5 p A/p F;KCNQ 4峰值電流約為550±50 p A,電流密度約為15±5 p A/p F。2.KCNQ通道與h Navβ1亞基的分子互作在全細(xì)胞膜片鉗模式下,記錄了HEK 293T細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1和KCNQ 4+h Navβ1的電流,分析峰值電流、I-V曲線、Id曲線。結(jié)果顯示:h Navβ1顯著增大了KCNQ 1的峰值電流,對KCNQ2、KCNQ 3、KCNQ 4的峰值電流無顯著影響。此外,h Navβ1顯著減小了KCNQ 1、KCNQ 2的電流密度,顯著增大了KCNQ 3、KCNQ 4的電流密度,表明h Navβ1亞基與KCNQ通道組合,可以差異性調(diào)控KCNQ通道的門控特性。3.胞外基質(zhì)(TNC/TNR)對KCNQ通道的調(diào)制在全細(xì)胞膜片鉗模式下,分別記錄HEK 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ 4后,孵育TNC或TNR的電流,分析峰值電流、I-V曲線、Id曲線。結(jié)果顯示:TNC顯著增強(qiáng)了KCNQ 2的峰值電流,顯著抑制了KCNQ 3、KCNQ4的峰值電流,而對KCNQ 1的峰值電流無影響;TNR顯著增大了KCNQ 1、KCNQ2、KCNQ 4的峰值電流,顯著減小了KCNQ 3的峰值電流。TNC顯著減小了KCNQ1、KCNQ 3的電流密度,顯著增大了KCNQ 2,對KCNQ 4的電流密度無顯著影響;TNR顯著減小了KCNQ 1、KCNQ 3的電流密度,增大了KCNQ 2的電流密度,對KCNQ 4的電流密度幾乎無影響。結(jié)果表明,TNC/TNR可以差異調(diào)節(jié)KCNQ鉀通道的電生理特性。4.胞外基質(zhì)(TNC/TNR)對KCNQ通道與Navβ1亞基組合的調(diào)控作用在全細(xì)胞膜片鉗模式下,分別記錄HEK 293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ 4與h Navβ1亞基后,孵育TNC/TNR的電流,得到KCNQ1+h Navβ1-TNC/TNR、KCNQ 2+h Navβ1-TNC/TNR、KCNQ 3+h Navβ1-TNC/TNR、1.KCNQ通道的門控動力學(xué)KCNQ 4+h Navβ1-TNC/TNR的峰值電流、I-V曲線、Id曲線。結(jié)果顯示:TNC顯著增大了KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 4+h Navβ1的峰值電流,對KCNQ3+h Navβ1的峰值電流無明顯影響;TNR顯著抑制了KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ3+h Navβ1的峰值電流,顯著增強(qiáng)了KCNQ 2+h Navβ1的峰值電流,對KCNQ4+h Navβ1的峰值電流幾乎無影響。TNC對KCNQ1+h Navβ1的電流密度幾乎無影響,顯著增大了KCNQ 2+h Navβ1的電流密度,減小了KCNQ 3+h Navβ1、KCNQ4+h Navβ1的電流密度;TNR顯著增大了KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 4+h Navβ1的電流密度;顯著減小了KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1電流密度,表明TNC/TN R與KCNQ鉀通道、h Navβ1亞基互作組合調(diào)控,影響鉀通道的門控特性。結(jié)論:h Navβ1亞基、TNC/TNR可以差異性調(diào)節(jié)KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ 4的電流。TNC/TNR可以差異性調(diào)節(jié)KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1、KCNQ 4+h Navβ1的電流。因此,明確KCNQ通道、h Navβ1亞基以及Tenascins之間的分子互作組合調(diào)控機(jī)制,有助于為解析鉀通道的差異性功能表達(dá)和靶向藥物篩制提供新思路。
【學(xué)位單位】：延安大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q25
【部分圖文】：

第一章 緒論最大貢獻(xiàn)者[25]。Kv 通道從功能上分為 A 型瞬時(shí)外向鉀通道、延遲外、介導(dǎo) M 電流的外向整流鉀通道和超速激活的延遲整流鉀通道[26]。外向整流鉀通道是由KCNQ通道亞基同源物或源自KCNQ 1-5基因成成[27]。壓門控鉀通道（Kv）是由α功能性亞基和β輔助亞基構(gòu)成的復(fù)合蛋白。-DIV 四個(gè)同源跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域有六次跨膜螺旋，細(xì)胞內(nèi)，電壓感受在于 S4 氨基酸殘基帶正電荷的，S 4-S 5 與 Kv 通道的開相關(guān)。N 端糖基化位點(diǎn)在細(xì)胞外，cATP 磷酸化位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)。S 6 螺Kv 通道的電壓敏感型起重要作用，因?yàn)?S 6 螺旋處 Pro-Val-Pro（PVP用，如圖 1[28]。

KCNQ 通道的 hNavβ1-Tenascins 分子組合調(diào)控研究第三章研究結(jié)果3.1 KCNQ 通道的門控動力學(xué)3.1.1 KCNQ 1 電流特性HEK 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 KCNQ 1，24 h 后記錄 KCNQ 1 通道電流。在全細(xì)胞膜片鉗模式下，采用圖 3-1 KCNQ 通道的刺激程序，將細(xì)胞膜電壓鉗制于-80 mV，以 10mV 的增量從-80 mV 步階進(jìn)至+30 mV，持續(xù)時(shí)間為 200 ms，誘導(dǎo)出 KCNQ 1 通道電流。圖 3-1-1 A 表示每個(gè)階躍測試電壓刺激下的 KCNQ 1 通道電流原始軌跡圖，圖 3-1-1 B 表示 KCNQ 1 的 I-V 曲線圖，電流幅度約為 400±50 pA，所做細(xì)胞個(gè)數(shù)n=6；圖 3-1-1 C 表示 KCNQ 1 通道的 Id 曲線圖，電流密度約為 70±5 pA/pF。

圖 3-1-2 KCNQ 2 電流特性Fig. 3-1-2 Electrophysiological characteristics of KCNQ 2圖 3-1-2A 為 KCNQ 2 通道電流原始軌跡圖；B 為以測試電壓 V(mV)為橫坐標(biāo)，電流 I(pA)為縱坐標(biāo)，KCNQ2 通道的 I-V 曲線圖；C 為以測試 V(mV)為橫坐標(biāo)，電流密度 Id(pA/pF)為縱坐標(biāo)的 Id 曲線圖；所有數(shù)據(jù)展示均采用 Mean±SEM。3.1.3 KCNQ 3 電流特性HEK 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 KCNQ 3，24 h 后記錄 KCNQ 3 電流。在全細(xì)胞膜片鉗模式下，采用圖 3-1 KCNQ 通道的刺激程序，將細(xì)胞膜電壓鉗制于-80 mV，以 10 mV的增量從-80 mV 步階進(jìn)至+30 mV，持續(xù)時(shí)間為 200 ms，誘導(dǎo)出 KCNQ 3 通道電流。圖 3-1-3A 表示正常情況下，每個(gè)階躍刺激的 KCNQ 3 通道原始電流軌跡圖，圖 3-1-3B 表示正常情況下，KCNQ 3 通道的 I-V 曲線圖，電流幅度約為 600±50 pA，所做細(xì)胞個(gè)數(shù) n=6，激活電壓約為-80 mV；圖 3-1-3 C 表示正常情況下，KCNQ 3 通道的Id 曲線圖，電流密度約為 20 pA/pF。

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本文編號：2833961