21世紀是生命科學的世紀,核酸作為生命體內(nèi)基本的遺傳物質(zhì),在生命活動中起決定性作用,因此對核酸檢測技術的創(chuàng)新研究是非常必要的。作為核酸檢測技術核心和難點的剪切和擴增技術成為全球性研究熱點。核酸特異性剪切主流技術主要有鋅指核酸酶(ZFNs),轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN),規(guī)律間隔性成簇短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR相關(Cas)蛋白9(CRISPR/Cas9)以及限制性核酸內(nèi)切酶(REase)。ZFNs和TALEN是基于FokI酶蛋白質(zhì)介導的DNA(脫氧核糖核酸)特異性剪切技術,需要對每個剪切的序列都設計與其對應的蛋白結構,實驗過程復雜;CRISPR/Cas9雖然簡化了實驗過程,但是它的向?qū)NA序列較長,在操作過程中可能形成二級結構,對實驗產(chǎn)生影響。REase由于其剪切特異性好,方便易得,實驗成本較低,較好地彌補上述技術的缺陷而得到廣泛應用。繼聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)后,發(fā)展了大量等溫擴增技術,其中指數(shù)等溫擴增反應(EXPAR)因其模板設計簡單,不需要引物等優(yōu)點備受青睞,但其在擴增長目標序列時會產(chǎn)生較強的非特異性擴增。在進行大量文獻分析和研究的基礎上,本論文開展了選擇性定位探針介導的等溫擴增檢測方法研究,選擇性定位探針與EXPAR聯(lián)用用于單堿基錯配檢測研究,基于適配體-磁珠介導選擇性定位探針與EXPAR新型檢測方法研究,主要創(chuàng)新性研究成果如下:1.發(fā)展了 一種選擇性定位探針(SPP)介導剪切技術(SPPMC)。其核心技術為設計了一種新型非對稱發(fā)卡結構的選擇性剪切探針,探針結構更穩(wěn)定,剪切效率更高,具有C堿基選擇性結合的識別位點,可以實現(xiàn)對不含REase識別位點的目標序列的單堿基編程任意位點剪切,具有良好的通用性。2.發(fā)展了一種SPPMC與EXPAR聯(lián)用(SPPMC-EXPAR)檢測技術。SPPMC剪切目標序列,得到的短序列用于EXPAR反應,可在一定程度上抑制了由于目標序列鏈長過長引起的非特異性擴增。實驗證明SPPMC-EXPAR可以實現(xiàn)對目標序列的短鏈間接檢測,有望實現(xiàn)高靈敏檢測。進一步對模板進行硫化優(yōu)化,使檢測靈敏度提高100倍。3.發(fā)展了一種基于SPPMC的C堿基錯配檢測方法。該方法分為SPPMC與EXPAR聯(lián)用的確證檢測方法,最低檢測濃度可達10-12M;以及SPPMC與凝膠電泳聯(lián)用的篩查方法,可檢測濃度大于10-7M的目標序列,該方法快速、簡便,具有良好的應用前景;4.發(fā)展了一種適配體-磁珠介導SPPMC-EXPAR新型檢測方法。該方法具有無需樣品前處理的高特異性檢測目標物識別、復雜體系中目標物快速分離、檢測信號自適應放大、高靈敏間接檢測等優(yōu)點。理論上該方法可實現(xiàn)高靈敏的甚至單分子檢測。甲基苯丙胺毒品檢測證明了該方法的有效性。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q503
【部分圖文】：

的高溫變性過程，在這個過程中是為了讓模板ＤＮＡ解旋成單鏈，（２）邋５０－６０°Ｃ退火逡逑過程，在此過程中引物和模板ＤＮＡ互補，（３）邋６８－７２邋°Ｃ延伸過程，在此階段在ＤＮＡ逡逑聚合酶作用下，引物沿著ＤＮＡ模板鏈發(fā)生擴增反應，其反應原理圖如圖１．１Ｐ］所示。逡逑ＰＣＲ技術具有特異性好，重復性好，可對目標序列實驗幾百萬倍的放大的優(yōu)點，在逡逑核酸研究領域成為主流的研究方法。在接下來的發(fā)展中，人們開發(fā)了一系列基本ＰＣＲ逡逑技術的核酸擴增方法ｔ３＿５ｌ大大豐富了核酸的檢測手段，擴大了邋ＰＣＲ技術的應用范逡逑圍。逡逑盡管ＰＣＲ應用范圍廣泛，但是自身仍存在缺陷，例如需要精準的控溫儀器，這逡逑類儀器往往價格昂貴，這增大了實驗成本。另一方面，ＰＣＲ技術中k胃鲅紛疃嘀誨義夏芾┰鲆槐恫錚獯蟠笤黽恿隋澹校茫曳從κ奔�，同蕩挪使ＰＣＲ灾o凳奔嗖庵惺艿藉義媳冉洗蟮南拗�。辶x舷啾扔冢校茫壹際�，等螀惟渣儚s缸畬蟮撓諾悖褐恍枰桓齪鬮祿肪常ū熱縊。╁義霞純煞⑸從

本文編號：2833509