21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì),核酸作為生命體內(nèi)基本的遺傳物質(zhì),在生命活動(dòng)中起決定性作用,因此對(duì)核酸檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新研究是非常必要的。作為核酸檢測(cè)技術(shù)核心和難點(diǎn)的剪切和擴(kuò)增技術(shù)成為全球性研究熱點(diǎn)。核酸特異性剪切主流技術(shù)主要有鋅指核酸酶(ZFNs),轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN),規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR相關(guān)(Cas)蛋白9(CRISPR/Cas9)以及限制性核酸內(nèi)切酶(REase)。ZFNs和TALEN是基于FokI酶蛋白質(zhì)介導(dǎo)的DNA(脫氧核糖核酸)特異性剪切技術(shù),需要對(duì)每個(gè)剪切的序列都設(shè)計(jì)與其對(duì)應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜;CRISPR/Cas9雖然簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程,但是它的向?qū)NA序列較長(zhǎng),在操作過程中可能形成二級(jí)結(jié)構(gòu),對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。REase由于其剪切特異性好,方便易得,實(shí)驗(yàn)成本較低,較好地彌補(bǔ)上述技術(shù)的缺陷而得到廣泛應(yīng)用。繼聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)后,發(fā)展了大量等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),其中指數(shù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)因其模板設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,不需要引物等優(yōu)點(diǎn)備受青睞,但其在擴(kuò)增長(zhǎng)目標(biāo)序列時(shí)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的非特異性擴(kuò)增。在進(jìn)行大量文獻(xiàn)分析和研究的基礎(chǔ)上,本論文開展了選擇性定位探針介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法研究,選擇性定位探針與EXPAR聯(lián)用用于單堿基錯(cuò)配檢測(cè)研究,基于適配體-磁珠介導(dǎo)選擇性定位探針與EXPAR新型檢測(cè)方法研究,主要?jiǎng)?chuàng)新性研究成果如下:1.發(fā)展了 一種選擇性定位探針(SPP)介導(dǎo)剪切技術(shù)(SPPMC)。其核心技術(shù)為設(shè)計(jì)了一種新型非對(duì)稱發(fā)卡結(jié)構(gòu)的選擇性剪切探針,探針結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,剪切效率更高,具有C堿基選擇性結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不含REase識(shí)別位點(diǎn)的目標(biāo)序列的單堿基編程任意位點(diǎn)剪切,具有良好的通用性。2.發(fā)展了一種SPPMC與EXPAR聯(lián)用(SPPMC-EXPAR)檢測(cè)技術(shù)。SPPMC剪切目標(biāo)序列,得到的短序列用于EXPAR反應(yīng),可在一定程度上抑制了由于目標(biāo)序列鏈長(zhǎng)過長(zhǎng)引起的非特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)證明SPPMC-EXPAR可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的短鏈間接檢測(cè),有望實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)。進(jìn)一步對(duì)模板進(jìn)行硫化優(yōu)化,使檢測(cè)靈敏度提高100倍。3.發(fā)展了一種基于SPPMC的C堿基錯(cuò)配檢測(cè)方法。該方法分為SPPMC與EXPAR聯(lián)用的確證檢測(cè)方法,最低檢測(cè)濃度可達(dá)10-12M;以及SPPMC與凝膠電泳聯(lián)用的篩查方法,可檢測(cè)濃度大于10-7M的目標(biāo)序列,該方法快速、簡(jiǎn)便,具有良好的應(yīng)用前景;4.發(fā)展了一種適配體-磁珠介導(dǎo)SPPMC-EXPAR新型檢測(cè)方法。該方法具有無需樣品前處理的高特異性檢測(cè)目標(biāo)物識(shí)別、復(fù)雜體系中目標(biāo)物快速分離、檢測(cè)信號(hào)自適應(yīng)放大、高靈敏間接檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。理論上該方法可實(shí)現(xiàn)高靈敏的甚至單分子檢測(cè)。甲基苯丙胺毒品檢測(cè)證明了該方法的有效性。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q503
【部分圖文】：

的高溫變性過程，在這個(gè)過程中是為了讓模板ＤＮＡ解旋成單鏈，（２）邋５０－６０°Ｃ退火逡逑過程，在此過程中引物和模板ＤＮＡ互補(bǔ)，（３）邋６８－７２邋°Ｃ延伸過程，在此階段在ＤＮＡ逡逑聚合酶作用下，引物沿著ＤＮＡ模板鏈發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，其反應(yīng)原理圖如圖１．１Ｐ］所示。逡逑ＰＣＲ技術(shù)具有特異性好，重復(fù)性好，可對(duì)目標(biāo)序列實(shí)驗(yàn)幾百萬倍的放大的優(yōu)點(diǎn)，在逡逑核酸研究領(lǐng)域成為主流的研究方法。在接下來的發(fā)展中，人們開發(fā)了一系列基本ＰＣＲ逡逑技術(shù)的核酸擴(kuò)增方法ｔ３＿５ｌ大大豐富了核酸的檢測(cè)手段，擴(kuò)大了邋ＰＣＲ技術(shù)的應(yīng)用范逡逑圍。逡逑盡管ＰＣＲ應(yīng)用范圍廣泛，但是自身仍存在缺陷，例如需要精準(zhǔn)的控溫儀器，這逡逑類儀器往往價(jià)格昂貴，這增大了實(shí)驗(yàn)成本。另一方面，ＰＣＲ技術(shù)中k胃鲅紛疃嘀誨義夏芾┰鲆槐恫錚獯蟠笤黽恿隋澹校茫曳從κ奔�，同蕩挪使ＰＣＲ灾o凳奔嗖庵惺艿藉義媳冉洗蟮南拗�。辶x舷啾扔冢校茫壹際酰任呂┰鼉弒缸畬蟮撓諾悖褐恍枰桓齪鬮祿肪常ū熱縊。╁義霞純煞⑸從

本文編號(hào)：2833509