發(fā)布時間：2020-10-08 23:43

　　 關(guān)節(jié)軟骨是滑膜關(guān)節(jié)中高度特化的結(jié)締組織,沒有神經(jīng)和血管,關(guān)節(jié)軟骨中唯一的軟骨生成細(xì)胞即軟骨細(xì)胞維持關(guān)節(jié)軟骨的正常功能。研究證明,軟骨細(xì)胞在生物力學(xué)的動態(tài)環(huán)境中保持軟骨基質(zhì)合成和降解之間的平衡。一旦這種平衡被軟骨細(xì)胞受到的異常機(jī)械或生物刺激破壞,軟骨組織通常會發(fā)生缺失,最終導(dǎo)致整個關(guān)節(jié)退化。因此,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物力學(xué)和力生物學(xué)在關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)和病理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用,并且一直受到廣泛的研究。軟骨細(xì)胞的生物力學(xué)特性主要取決于細(xì)胞骨架,尤其是肌動蛋白細(xì)胞骨架。肌動蛋白已經(jīng)被證明可調(diào)控軟骨細(xì)胞的表型、硬度、粘彈性和對機(jī)械/化學(xué)刺激的反應(yīng)等一系列特征。與其他真核細(xì)胞一樣,軟骨細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)通過黏著斑連接。斑聯(lián)蛋白是一種集中在黏著斑的LIM蛋白,作為應(yīng)力敏感蛋白,斑聯(lián)蛋白能夠響應(yīng)力學(xué)信號在黏著斑上移動并重新定位到肌動蛋白應(yīng)力纖維。斑聯(lián)蛋白含有許多活躍的結(jié)構(gòu)域,包括三個參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的碳末端LIM結(jié)構(gòu)域、與Ena/血管舒張活化的磷酸化蛋白(VASP)家族成員相互作用的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域、用于在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間轉(zhuǎn)移的核輸出信號。已有研究表明斑聯(lián)蛋白可以啟動成纖維細(xì)胞中肌動蛋白細(xì)胞骨架的重塑,能夠加強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架。研究表明斑聯(lián)蛋白可以重組細(xì)胞外分泌顆粒周圍的肌動蛋白纖維,調(diào)控內(nèi)皮血管性血友病因子的分泌。然而,斑聯(lián)蛋白在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架中的作用尚未被闡明。黏著斑蛋白可以強(qiáng)化細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與基質(zhì)的粘連,是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白,也是基于整合素與基于鈣粘蛋白的粘附復(fù)合物的組成成分,分別通過與踝蛋白與ɑ-粘連蛋白的相互作用對力學(xué)信號快速響應(yīng)并被招募到這兩種類型的黏著斑。黏著斑蛋白能夠形成肌動蛋白細(xì)胞骨架與黏著斑的極化連接,在維持組織完整性中起重要作用,對于持續(xù)性的細(xì)胞定向遷移也是必需的。研究表明,黏著斑蛋白和斑聯(lián)蛋白共定位于黏著斑。因此,黏著斑蛋白可能會參與肌動蛋白和斑聯(lián)蛋白之間的相互作用。本研究中,我們通過構(gòu)建兔斑聯(lián)蛋白低表達(dá)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞模型研究斑聯(lián)蛋白對肌動蛋白細(xì)胞骨架和黏著斑蛋白的調(diào)節(jié)作用,并進(jìn)行了免疫熒光、定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡來檢測軟骨細(xì)胞肌動蛋白和黏著斑蛋白表達(dá)及膠原蛋白合成的變化。結(jié)果顯示:軟骨細(xì)胞斑聯(lián)蛋白的低表達(dá)增加球狀肌動蛋白(G-actin)與絲狀肌動蛋白(F-actin)的比值,并抑制了黏著斑蛋白、軟骨形成標(biāo)記物II型膠原蛋白以及肥大標(biāo)記物X型膠原蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)已被證明通過Ras同源基因家族成員A(RhoA)途徑調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架,所以為研究肌動蛋白對斑聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的作用,我們采用TGF-β1處理軟骨細(xì)胞并檢測斑聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的變化。結(jié)果顯示:經(jīng)TGF-β1處理后,軟骨細(xì)胞絲狀肌動蛋白的表達(dá)增強(qiáng),斑聯(lián)蛋白的表達(dá)減弱。同時,因TGF-β1處理后軟骨細(xì)胞肌動蛋白發(fā)生聚合,導(dǎo)致黏著斑蛋白和去分化標(biāo)記物I型膠原蛋白的表達(dá)增強(qiáng),而II型膠原蛋白和蛋白聚糖的表達(dá)減弱。這些結(jié)果顯示:在軟骨細(xì)胞中,斑聯(lián)蛋白的表達(dá)水平與肌動蛋白的聚合狀態(tài)密切相關(guān),并且斑聯(lián)蛋白和絲狀肌動蛋白的變化分別與II型膠原蛋白和黏著斑蛋白的變化保持一致,表明斑聯(lián)蛋白與肌動蛋白的相互作用在膠原細(xì)胞外基質(zhì)的合成和細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附重塑中起重要作用。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q418
【部分圖文】：

第一章 4 實驗結(jié)果4 實驗結(jié)果染軟骨細(xì)胞以敲低斑聯(lián)蛋白基因的染軟骨細(xì)胞后用 qRT-PCR 驗證斑聯(lián)蛋白基的干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白干擾軟骨細(xì)胞后用 qRT-PCR 反應(yīng)檢測了斑聯(lián)向沉默信號的干擾 RNA 對照（NC）的 #627、#1009 和#1448 的軟骨細(xì)胞中斑聯(lián)%、43.68±4.5%和 47.13±11.4%。在這些斑 RNA 基因敲低的效果最佳，被用于后續(xù)

沉默信號的干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白干擾 RNA #1熒光圖。綠色熒光表示斑聯(lián)蛋白，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核。沉默信號的干擾 RNA 對照（NC）與斑聯(lián)蛋白干擾 R蛋白質(zhì)免疫印跡檢測斑聯(lián)蛋白的表達(dá)默信號的干擾 RNA 對照（NC）與斑聯(lián)蛋白干擾 RN胞后用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測斑聯(lián)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯的干擾 RNA 對照（NC）的軟骨細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染斑聯(lián)胞中斑聯(lián)蛋白的表達(dá)量下降到 63.98±8.38%。

的干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白干擾，*表示 P 值小于 0.05。基因后軟骨細(xì)胞絲狀肌動蛋白的的干擾 RNA 對照（NC）與斑聯(lián)蛋疫熒光染色與細(xì)胞骨架鬼筆環(huán)肽染干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白斑聯(lián)蛋白免疫熒光染色與細(xì)胞骨架色結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染非靶向沉默信號斑聯(lián)蛋白干擾 RNA#1009 的軟骨細(xì)的熒光較弱。

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本文編號：2832919