關節(jié)軟骨是滑膜關節(jié)中高度特化的結締組織,沒有神經(jīng)和血管,關節(jié)軟骨中唯一的軟骨生成細胞即軟骨細胞維持關節(jié)軟骨的正常功能。研究證明,軟骨細胞在生物力學的動態(tài)環(huán)境中保持軟骨基質合成和降解之間的平衡。一旦這種平衡被軟骨細胞受到的異常機械或生物刺激破壞,軟骨組織通常會發(fā)生缺失,最終導致整個關節(jié)退化。因此,關節(jié)軟骨細胞的生物力學和力生物學在關節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)和病理學中起著至關重要的作用,并且一直受到廣泛的研究。軟骨細胞的生物力學特性主要取決于細胞骨架,尤其是肌動蛋白細胞骨架。肌動蛋白已經(jīng)被證明可調控軟骨細胞的表型、硬度、粘彈性和對機械/化學刺激的反應等一系列特征。與其他真核細胞一樣,軟骨細胞的肌動蛋白細胞骨架和細胞外基質(ECM)通過黏著斑連接。斑聯(lián)蛋白是一種集中在黏著斑的LIM蛋白,作為應力敏感蛋白,斑聯(lián)蛋白能夠響應力學信號在黏著斑上移動并重新定位到肌動蛋白應力纖維。斑聯(lián)蛋白含有許多活躍的結構域,包括三個參與蛋白質與蛋白質相互作用的碳末端LIM結構域、與Ena/血管舒張活化的磷酸化蛋白(VASP)家族成員相互作用的富含脯氨酸的結構域、用于在細胞核與細胞質之間轉移的核輸出信號。已有研究表明斑聯(lián)蛋白可以啟動成纖維細胞中肌動蛋白細胞骨架的重塑,能夠加強氣道平滑肌細胞的肌動蛋白細胞骨架。研究表明斑聯(lián)蛋白可以重組細胞外分泌顆粒周圍的肌動蛋白纖維,調控內皮血管性血友病因子的分泌。然而,斑聯(lián)蛋白在調節(jié)軟骨細胞肌動蛋白細胞骨架中的作用尚未被闡明。黏著斑蛋白可以強化細胞與細胞及細胞與基質的粘連,是一種肌動蛋白結合蛋白,也是基于整合素與基于鈣粘蛋白的粘附復合物的組成成分,分別通過與踝蛋白與ɑ-粘連蛋白的相互作用對力學信號快速響應并被招募到這兩種類型的黏著斑。黏著斑蛋白能夠形成肌動蛋白細胞骨架與黏著斑的極化連接,在維持組織完整性中起重要作用,對于持續(xù)性的細胞定向遷移也是必需的。研究表明,黏著斑蛋白和斑聯(lián)蛋白共定位于黏著斑。因此,黏著斑蛋白可能會參與肌動蛋白和斑聯(lián)蛋白之間的相互作用。本研究中,我們通過構建兔斑聯(lián)蛋白低表達關節(jié)軟骨細胞模型研究斑聯(lián)蛋白對肌動蛋白細胞骨架和黏著斑蛋白的調節(jié)作用,并進行了免疫熒光、定量即時聚合酶鏈鎖反應(qRT-PCR)和蛋白質免疫印跡來檢測軟骨細胞肌動蛋白和黏著斑蛋白表達及膠原蛋白合成的變化。結果顯示:軟骨細胞斑聯(lián)蛋白的低表達增加球狀肌動蛋白(G-actin)與絲狀肌動蛋白(F-actin)的比值,并抑制了黏著斑蛋白、軟骨形成標記物II型膠原蛋白以及肥大標記物X型膠原蛋白的表達。轉化生長因子β1(TGF-β1)已被證明通過Ras同源基因家族成員A(RhoA)途徑調節(jié)軟骨細胞的肌動蛋白細胞骨架,所以為研究肌動蛋白對斑聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的作用,我們采用TGF-β1處理軟骨細胞并檢測斑聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的變化。結果顯示:經(jīng)TGF-β1處理后,軟骨細胞絲狀肌動蛋白的表達增強,斑聯(lián)蛋白的表達減弱。同時,因TGF-β1處理后軟骨細胞肌動蛋白發(fā)生聚合,導致黏著斑蛋白和去分化標記物I型膠原蛋白的表達增強,而II型膠原蛋白和蛋白聚糖的表達減弱。這些結果顯示:在軟骨細胞中,斑聯(lián)蛋白的表達水平與肌動蛋白的聚合狀態(tài)密切相關,并且斑聯(lián)蛋白和絲狀肌動蛋白的變化分別與II型膠原蛋白和黏著斑蛋白的變化保持一致,表明斑聯(lián)蛋白與肌動蛋白的相互作用在膠原細胞外基質的合成和細胞骨架與細胞外基質的粘附重塑中起重要作用。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q418
【部分圖文】：

第一章 4 實驗結果4 實驗結果染軟骨細胞以敲低斑聯(lián)蛋白基因的染軟骨細胞后用 qRT-PCR 驗證斑聯(lián)蛋白基的干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白干擾軟骨細胞后用 qRT-PCR 反應檢測了斑聯(lián)向沉默信號的干擾 RNA 對照（NC）的 #627、#1009 和#1448 的軟骨細胞中斑聯(lián)%、43.68±4.5%和 47.13±11.4%。在這些斑 RNA 基因敲低的效果最佳，被用于后續(xù)

沉默信號的干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白干擾 RNA #1熒光圖。綠色熒光表示斑聯(lián)蛋白，藍色熒光表示細胞核。沉默信號的干擾 RNA 對照（NC）與斑聯(lián)蛋白干擾 R蛋白質免疫印跡檢測斑聯(lián)蛋白的表達默信號的干擾 RNA 對照（NC）與斑聯(lián)蛋白干擾 RN胞后用蛋白質免疫印跡檢測斑聯(lián)蛋白的表達。結果顯的干擾 RNA 對照（NC）的軟骨細胞相比，轉染斑聯(lián)胞中斑聯(lián)蛋白的表達量下降到 63.98±8.38%。

的干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白干擾，*表示 P 值小于 0.05�；蚝筌浌羌毎z狀肌動蛋白的的干擾 RNA 對照（NC）與斑聯(lián)蛋疫熒光染色與細胞骨架鬼筆環(huán)肽染干擾 RNA 對照（NC）和斑聯(lián)蛋白斑聯(lián)蛋白免疫熒光染色與細胞骨架色結果顯示：與轉染非靶向沉默信號斑聯(lián)蛋白干擾 RNA#1009 的軟骨細的熒光較弱。

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本文編號：2832919