成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其關(guān)聯(lián)蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)構(gòu)成的CRISPR-Cas系統(tǒng)是存在于大多數(shù)細(xì)菌與所有古菌中的一種后天免疫系統(tǒng),通過(guò)對(duì)外來(lái)DNA的識(shí)別、整合、表達(dá)、干擾來(lái)對(duì)抗入侵的質(zhì)�；蚴删w,目前已被廣泛應(yīng)用于基因定向敲除、添加、激活或抑制等遺傳操作中。基于Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)發(fā)展起來(lái)的CRISPR-Cas9已經(jīng)成為繼第一代鋅指核酸酶(ZFN)和第二代轉(zhuǎn)錄激活因子樣核酸酶(TALEN)之后的第三代基因編輯系統(tǒng)。與ZFN和TALEN基因編輯工具相比,CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有剪切高效、構(gòu)建簡(jiǎn)單及成本低廉等優(yōu)勢(shì),但其在編輯的過(guò)程中仍存在靶基因的編輯效率差異大,部分靶位點(diǎn)編輯效率低下等問(wèn)題。為了提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的編輯效率,本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)的單一轉(zhuǎn)錄單元CRISPR-Cas9(Single transcript unit CRISPR-Cas9)植物基因組編輯系統(tǒng)進(jìn)一步改造優(yōu)化,通過(guò)將Cas9蛋白與不同泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin Associated domain,UBA)UBA1、UBA2、UBA3分別融合,構(gòu)建CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)。進(jìn)一步選擇三個(gè)水稻內(nèi)源基因的不同靶位點(diǎn)構(gòu)建CRISPR-Cas9-UBA定向編輯表達(dá)載體,利用原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系分別檢測(cè)其剪切活性及編輯效率,從而評(píng)價(jià)不同UBA結(jié)構(gòu)域?qū)as9蛋白活性及編輯效率的影響。本研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:1.通過(guò)對(duì)不同泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域的比較,篩選來(lái)源擬南芥的UBA1、UBA2、UBA3結(jié)構(gòu)域,進(jìn)行水稻密碼子的偏好優(yōu)化,以本實(shí)驗(yàn)室CRISPR-Cas9系統(tǒng)的pTX172為骨架載體,構(gòu)建獲得三個(gè)CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)載體pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03。2.選擇與水稻白化、矮化、卷葉表型相關(guān)的三個(gè)內(nèi)源基因OsPDS、OsDEP1、OsROC5為報(bào)告基因,以前期實(shí)驗(yàn)中編輯效率相對(duì)較低的OsPDS-sgRNA01、OsPDS-sgRNA02、OsDEP1-sgRNA02、OsROC5-sgRNA01四個(gè)靶位點(diǎn)為研究對(duì)象,基于三個(gè)CRISPR-Cas9-UBA系統(tǒng)pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03及對(duì)照CRISPR-Cas9系統(tǒng)pTX172分別構(gòu)建針對(duì)以上四個(gè)靶位點(diǎn)的16個(gè)定向編輯表達(dá)載體。3.通過(guò)PEG介導(dǎo)的水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,對(duì)融合不同UBA結(jié)構(gòu)域的Cas9蛋白的剪切活性進(jìn)行了初步檢測(cè),結(jié)果顯示與對(duì)照組CRISPR-Cas9相比,三個(gè)CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)在四個(gè)靶位點(diǎn)均有剪切活性,說(shuō)明UBA1、UBA2、UBA3結(jié)構(gòu)域?qū)as9蛋白的剪切活性沒(méi)有影響,可以用于進(jìn)一步的基因編輯效率研究。4.進(jìn)一步以O(shè)sPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02位點(diǎn)為研究對(duì)象,在日本晴水稻品種中進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化,對(duì)再生的轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測(cè)、表型分析及突變效率比較,用來(lái)評(píng)價(jià)CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)的有效性、穩(wěn)定性和編輯效率差異�；赑CR-RFLP和測(cè)序的基因型分析,三個(gè)CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)對(duì)水稻Qg源基因的剪切位點(diǎn)與對(duì)照CRISPR-Cas9系統(tǒng)一致,大部分是雙等位基因或其中一個(gè)等位基因在PAM鄰近端3-4位置處1bp堿基的缺失或插入。說(shuō)明融合UBA1、UBA2、UBA3結(jié)構(gòu)域?qū)as9蛋白的剪切作用模式?jīng)]有明顯的影響。對(duì)突變體植株表型分析顯示:對(duì)照CRISPR-Cas9系統(tǒng)和三個(gè)CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變植株表型沒(méi)有明顯差異。這表明CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)在誘導(dǎo)產(chǎn)生突變的作用機(jī)制上與CRISPR-Cas9系統(tǒng)沒(méi)有明顯差異,可以用于基因定向編輯及突變體創(chuàng)制。5.與CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)對(duì)比,三個(gè)CRISPR-Cas9-UBA系統(tǒng)在OsPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02兩個(gè)靶位點(diǎn)上均能有效引導(dǎo)基因突變,且基因編輯效率都有顯著提高。其中,融合UBA2結(jié)構(gòu)域的CRISPR-Cas9-UBA2系統(tǒng)定向編輯效率最高。
【學(xué)位單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q78;S511
【部分圖文】：

圖 1-1 體內(nèi)基因組 DNA 修復(fù)途徑示意圖[8]與傳統(tǒng)的基因突變機(jī)制相比，基因編輯技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行定向編輯，具有簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)，高效性等優(yōu)勢(shì)。基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程，如圖 1-2 所示[9979 年，Scherer 和 Davis 利用質(zhì)粒將外源基因成功轉(zhuǎn)入釀酒酵母的基因組中，了外源基因的正常表達(dá)，這標(biāo)志著基因組編輯技術(shù)的正式形成[10]。1985 年，家利用同源重組將一段外源質(zhì)粒序列插入到人染色體的 β-珠蛋白位點(diǎn)[11]，首哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因打靶并獲得成功。隨后同源重組這種基因編輯技術(shù)功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物、糧食作物和微生物研究，可以對(duì)目標(biāo)基因或基因的部分進(jìn)行刪除、替代，或在細(xì)胞內(nèi)存在同源序列的情況下插入外源 DNA 序列。，該方法重組頻率較低，僅為 10-4-10-5。對(duì)于高等植物或動(dòng)物，其效率更低實(shí)踐上難以廣泛應(yīng)用。高等動(dòng)、植物中同源重組效率低可能是由于這些細(xì)胞同源重組酶效率不高。有研究表明，轉(zhuǎn)入外源的同源重組酶基因后，這些物的同源重組效率提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)[12-14]。在同源重組基因組編輯技術(shù)興起的同時(shí)，Kim 研究團(tuán)隊(duì)將人工改造鋅指蛋

第一章 緒論DNA 序列進(jìn)行雙切口切割，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生非同源末端連接修復(fù)，造成目的基因的突變[41]，這一方法具有高精確度和高特異性，也成為了目前對(duì) DNA 進(jìn)行大片段整體敲除的通用方法。2013 年，Gennequin 等研究者利用 CRISPR-Cas9 技術(shù)對(duì)小鼠 Cnr2 基因位點(diǎn)進(jìn)行人源化改造，證實(shí)這項(xiàng)技術(shù)可以用于 DNA 大片段的同源整合，將大大增強(qiáng)我們產(chǎn)生各種轉(zhuǎn)基因小鼠模型的能力[42]。在此之后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種模式生物的研究中[43]，利用它進(jìn)行基因功能探索、潛在藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證，以及由已知遺傳因素導(dǎo)致的疾病的治療[44]。

第二章 材料與方法圖 2-1 pTX172 載體示意圖.1.2 CRISPR-Cas9-UBA 基因編輯系統(tǒng)骨架載體本研究篩選獲取泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域 UBA1 和 UBA2 分別來(lái)自擬南芥 RAD2族中 RAD23a（AT1G16190）蛋白的第 143 186 位氨基酸、第 323 361 位，UBA3 來(lái)自擬南芥 DDI1（AT3G13235）蛋白的第 375 411 位氨基酸[62]，A1、UBA2、UBA3 結(jié)構(gòu)域在擬南芥染色體上的位置，如 2-2 示意圖所示。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 江云珠;沈希宏;曹立勇;;國(guó)外水稻育種研究近況[J];中國(guó)稻米;2011年05期

2 梁成偉;程江峰;蘇忠亮;梁琰;王帥;;八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因分子進(jìn)化特征[J];青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年05期

3 石利娟;鄧啟云;劉國(guó)華;莊文;陳立云;;水稻理想株型育種研究進(jìn)展[J];雜交水稻;2006年04期

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 章登位;水稻理想株型定向突變體創(chuàng)制及分析[D];電子科技大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2825985