發(fā)布時間：2020-09-24 16:44

　　 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其關(guān)聯(lián)蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)構(gòu)成的CRISPR-Cas系統(tǒng)是存在于大多數(shù)細菌與所有古菌中的一種后天免疫系統(tǒng),通過對外來DNA的識別、整合、表達、干擾來對抗入侵的質(zhì)粒或噬菌體,目前已被廣泛應(yīng)用于基因定向敲除、添加、激活或抑制等遺傳操作中。基于Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)發(fā)展起來的CRISPR-Cas9已經(jīng)成為繼第一代鋅指核酸酶(ZFN)和第二代轉(zhuǎn)錄激活因子樣核酸酶(TALEN)之后的第三代基因編輯系統(tǒng)。與ZFN和TALEN基因編輯工具相比,CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有剪切高效、構(gòu)建簡單及成本低廉等優(yōu)勢,但其在編輯的過程中仍存在靶基因的編輯效率差異大,部分靶位點編輯效率低下等問題。為了提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的編輯效率,本研究對實驗室前期開發(fā)的單一轉(zhuǎn)錄單元CRISPR-Cas9(Single transcript unit CRISPR-Cas9)植物基因組編輯系統(tǒng)進一步改造優(yōu)化,通過將Cas9蛋白與不同泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin Associated domain,UBA)UBA1、UBA2、UBA3分別融合,構(gòu)建CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)。進一步選擇三個水稻內(nèi)源基因的不同靶位點構(gòu)建CRISPR-Cas9-UBA定向編輯表達載體,利用原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系分別檢測其剪切活性及編輯效率,從而評價不同UBA結(jié)構(gòu)域?qū)as9蛋白活性及編輯效率的影響。本研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:1.通過對不同泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域的比較,篩選來源擬南芥的UBA1、UBA2、UBA3結(jié)構(gòu)域,進行水稻密碼子的偏好優(yōu)化,以本實驗室CRISPR-Cas9系統(tǒng)的pTX172為骨架載體,構(gòu)建獲得三個CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)載體pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03。2.選擇與水稻白化、矮化、卷葉表型相關(guān)的三個內(nèi)源基因OsPDS、OsDEP1、OsROC5為報告基因,以前期實驗中編輯效率相對較低的OsPDS-sgRNA01、OsPDS-sgRNA02、OsDEP1-sgRNA02、OsROC5-sgRNA01四個靶位點為研究對象,基于三個CRISPR-Cas9-UBA系統(tǒng)pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03及對照CRISPR-Cas9系統(tǒng)pTX172分別構(gòu)建針對以上四個靶位點的16個定向編輯表達載體。3.通過PEG介導(dǎo)的水稻原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系,對融合不同UBA結(jié)構(gòu)域的Cas9蛋白的剪切活性進行了初步檢測,結(jié)果顯示與對照組CRISPR-Cas9相比,三個CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)在四個靶位點均有剪切活性,說明UBA1、UBA2、UBA3結(jié)構(gòu)域?qū)as9蛋白的剪切活性沒有影響,可以用于進一步的基因編輯效率研究。4.進一步以O(shè)sPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02位點為研究對象,在日本晴水稻品種中進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化,對再生的轉(zhuǎn)基因植株靶位點進行突變檢測、表型分析及突變效率比較,用來評價CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)的有效性、穩(wěn)定性和編輯效率差異�；赑CR-RFLP和測序的基因型分析,三個CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)對水稻Qg源基因的剪切位點與對照CRISPR-Cas9系統(tǒng)一致,大部分是雙等位基因或其中一個等位基因在PAM鄰近端3-4位置處1bp堿基的缺失或插入。說明融合UBA1、UBA2、UBA3結(jié)構(gòu)域?qū)as9蛋白的剪切作用模式?jīng)]有明顯的影響。對突變體植株表型分析顯示:對照CRISPR-Cas9系統(tǒng)和三個CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變植株表型沒有明顯差異。這表明CRISPR-Cas9-UBA基因編輯系統(tǒng)在誘導(dǎo)產(chǎn)生突變的作用機制上與CRISPR-Cas9系統(tǒng)沒有明顯差異,可以用于基因定向編輯及突變體創(chuàng)制。5.與CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)對比,三個CRISPR-Cas9-UBA系統(tǒng)在OsPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02兩個靶位點上均能有效引導(dǎo)基因突變,且基因編輯效率都有顯著提高。其中,融合UBA2結(jié)構(gòu)域的CRISPR-Cas9-UBA2系統(tǒng)定向編輯效率最高。
【學(xué)位單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;S511
【部分圖文】：

圖 1-1 體內(nèi)基因組 DNA 修復(fù)途徑示意圖[8]與傳統(tǒng)的基因突變機制相比，基因編輯技術(shù)對靶基因進行定向編輯，具有簡單、可控性強，高效性等優(yōu)勢�；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展歷程，如圖 1-2 所示[9979 年，Scherer 和 Davis 利用質(zhì)粒將外源基因成功轉(zhuǎn)入釀酒酵母的基因組中，了外源基因的正常表達，這標志著基因組編輯技術(shù)的正式形成[10]。1985 年，家利用同源重組將一段外源質(zhì)粒序列插入到人染色體的 β-珠蛋白位點[11]，首哺乳動物細胞中進行基因打靶并獲得成功。隨后同源重組這種基因編輯技術(shù)功應(yīng)用于哺乳動物、糧食作物和微生物研究，可以對目標基因或基因的部分進行刪除、替代，或在細胞內(nèi)存在同源序列的情況下插入外源 DNA 序列。，該方法重組頻率較低，僅為 10-4-10-5。對于高等植物或動物，其效率更低實踐上難以廣泛應(yīng)用。高等動、植物中同源重組效率低可能是由于這些細胞同源重組酶效率不高。有研究表明，轉(zhuǎn)入外源的同源重組酶基因后，這些物的同源重組效率提高了一個數(shù)量級[12-14]。在同源重組基因組編輯技術(shù)興起的同時，Kim 研究團隊將人工改造鋅指蛋

第一章 緒論DNA 序列進行雙切口切割，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生非同源末端連接修復(fù)，造成目的基因的突變[41]，這一方法具有高精確度和高特異性，也成為了目前對 DNA 進行大片段整體敲除的通用方法。2013 年，Gennequin 等研究者利用 CRISPR-Cas9 技術(shù)對小鼠 Cnr2 基因位點進行人源化改造，證實這項技術(shù)可以用于 DNA 大片段的同源整合，將大大增強我們產(chǎn)生各種轉(zhuǎn)基因小鼠模型的能力[42]。在此之后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種模式生物的研究中[43]，利用它進行基因功能探索、潛在藥物靶點驗證，以及由已知遺傳因素導(dǎo)致的疾病的治療[44]。

第二章 材料與方法圖 2-1 pTX172 載體示意圖.1.2 CRISPR-Cas9-UBA 基因編輯系統(tǒng)骨架載體本研究篩選獲取泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域 UBA1 和 UBA2 分別來自擬南芥 RAD2族中 RAD23a（AT1G16190）蛋白的第 143 186 位氨基酸、第 323 361 位，UBA3 來自擬南芥 DDI1（AT3G13235）蛋白的第 375 411 位氨基酸[62]，A1、UBA2、UBA3 結(jié)構(gòu)域在擬南芥染色體上的位置，如 2-2 示意圖所示。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 江云珠;沈希宏;曹立勇;;國外水稻育種研究近況[J];中國稻米;2011年05期

2 梁成偉;程江峰;蘇忠亮;梁琰;王帥;;八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因分子進化特征[J];青島科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年05期

3 石利娟;鄧啟云;劉國華;莊文;陳立云;;水稻理想株型育種研究進展[J];雜交水稻;2006年04期

4 呂艷東;郭曉紅;鄭桂萍;陳書強;;水稻理想株型的研究進展[J];墾殖與稻作;2006年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 章登位;水稻理想株型定向突變體創(chuàng)制及分析[D];電子科技大學(xué);2017年

本文編號：2825985