“溫室效應(yīng)”導(dǎo)致全球變暖,嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育,導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低。研究植物高溫應(yīng)答分子機(jī)制是目前國(guó)際上的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。菠菜(Spinicia oleracea L.)是我國(guó)重要的綠葉蔬菜,研究其熱應(yīng)答分子調(diào)控機(jī)制,對(duì)利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)培育耐熱抗病菠菜新品種具有重要意義。Pto-interacting 1(PTI1)基因編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與調(diào)控ROS平衡和MAPK信號(hào)通路,以及脂類(lèi)代謝等多種過(guò)程,研究PTI1對(duì)高溫應(yīng)答調(diào)控作用將為深入解析植物高溫應(yīng)答分子機(jī)制提供重要信息。我們?cè)诓げ嘶蚪M中發(fā)現(xiàn)4個(gè)編碼PTI1蛋白的基因,其蛋白同源相似性達(dá)68.38%。我們克隆到Spo PTI1-3基因,其最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?224bp,共編碼407個(gè)氨基酸,理論分子質(zhì)量為45.19k Da。Spo PTI1-3蛋白與多種植物的PTI1蛋白同源性都較高,且在多個(gè)不同物種間,PTI1蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域、磷酸化功能位點(diǎn)、半胱氨酸位點(diǎn)都較為保守。煙草瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明Spo PTI1-3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。在菠菜六葉期不同組織器官中Spo PTI1-3基因在須根中的基因表達(dá)量最高,在第一對(duì)真葉中的基因表達(dá)量最低。在菠菜抽薹期不同組織器官中Spo PTI1-3基因在新莖中表達(dá)量最高,在老葉中表達(dá)量最低。熒光定量PCR分析表明,經(jīng)37℃高溫處理后,菠菜耐熱材料Sp75葉片中Spo PTI1-3基因的表達(dá)量與對(duì)照組菠菜熱敏感材料Sp73相比一直為下降趨勢(shì),這表明高溫脅迫下Spo PTI1-3基因的表達(dá)受到抑制。但在200m M Na Cl、100m M Na2CO3,200m M Na HCO3以及200μM Cd Cl2處理下,Spo PTI1-3基因表達(dá)量均上升,這說(shuō)明Spo PTI1-3響應(yīng)鹽脅迫及重金屬脅迫。Spo PTI1-3基因的高溫應(yīng)答表達(dá)模式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,37℃高溫處理下,野生型酵母菌株與Spo PTI1-3過(guò)表達(dá)酵母菌株的生長(zhǎng)皆受到抑制,但過(guò)表達(dá)酵母菌株與野生型相比對(duì)高溫更加敏感,這說(shuō)明高溫脅迫下Spo PTI1-3基因起負(fù)調(diào)控作用。但在Spo PTI1-3基因在不同鹽處理下的應(yīng)答表達(dá)模式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在不同鹽脅迫下,隨著處理濃度的增加,酵母的生長(zhǎng)狀況也隨之減慢,野生型與過(guò)表達(dá)酵母菌株相比對(duì)鹽更加敏感。這表明Spo PTI1-3蛋白能夠響應(yīng)鹽脅迫。酵母雙雜交試驗(yàn)分析表明,Spo PTI1-3蛋白與Spo OXI1-1蛋白之間并無(wú)互作關(guān)系。過(guò)表達(dá)Spo PTI1-3基因后,擬南芥根長(zhǎng)被抑制,但根毛數(shù)量明顯增多,特別在突變體基因回補(bǔ)擬南芥表型中,此特征更為明顯。并且過(guò)表達(dá)Spo PTI1-3擬南芥和基因回補(bǔ)擬南芥同對(duì)照組相比,抽薹期更早。這表明Spo PTI1-3蛋白與At PTI1-3蛋白相比,其功能可能更強(qiáng)。
【學(xué)位單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q943.2;S636.1
【部分圖文】：

文獻(xiàn)綜述 上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文1.5 研究目的及意義高溫會(huì)影響植物的各種生理生化過(guò)程，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)植物適應(yīng)高溫脅迫的研究從生理水平步入分子水平，研究的目的不僅在于從分子水平上解釋植物響應(yīng)高溫脅迫的機(jī)制，而是更希望獲得各種抗高溫基因，用于作物育種。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，菠菜 PTI-1 基因和蛋白質(zhì)都受到高溫誘導(dǎo)，很可能會(huì)在高溫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。所以明確菠菜PTI1-3基因是否高溫應(yīng)答、分析菠菜 PTI1-3 基因參與何種調(diào)控的信號(hào)與代謝通路，對(duì)于深入理解菠菜高溫應(yīng)答分子機(jī)制，并將其應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。1.6 本試驗(yàn)技術(shù)路線(xiàn)

圖 3-2 可知，擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期一致，將條帶進(jìn)行切膠回收，與克隆-5861 進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，菌液 PCR 和雙酶切驗(yàn)證后，送公司序，測(cè)序結(jié)果表明，如圖 3-3 圖，已獲得 SpoPTI1-3 基因的 cDNA 序列。000bp000bp2000bp1000bpM 1 M 12000bp1000bpSpoPTI1-3 基因c-5861 載體圖 3-2 SpoPTI1-3 基因全長(zhǎng)的獲得M：DL 2000 DNAMarker；（a）SpoPTI1-3 基因的擴(kuò)增；（b）特異引物 PCR 篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；（c）重組質(zhì)粒載體的酶切產(chǎn)物；Fig. 3-2 Full-length sequence amplification of SpoPTI1-3 by PCR

由圖 3-2 可知，擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期一致，將條帶進(jìn)行切膠回收，與克隆載體 C-5861 進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，菌液 PCR 和雙酶切驗(yàn)證后，送公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，如圖 3-3 圖，已獲得 SpoPTI1-3 基因的 cDNA 序列。

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1 董美辰;菠菜SpoPTI1-3基因克隆及其高溫應(yīng)答功能分析[D];上海師范大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2826558