發(fā)布時間：2020-09-24 14:04

　　 GW182又名TNRC6A,是RNA干擾過程中的核心蛋白,其與TNRC6B和TNRC6C為同源蛋白。已有研究表明,GW182可以作為骨架蛋白與AGO2(argonaute 2)及其他RNA干擾蛋白整合在一起并形成更大的蛋白復合體。但是,一直以來,研究人員大都致力于研究AGO2在細胞內(nèi)的生物學作用,而對于TNRC6A,甚至TNRC6蛋白家族在細胞中的具體作用并沒有深入的研究和了解。鑒于此,本研究利用小RNA在哺乳動物細胞系中對TNRC6家族基因進行了敲低和敲除,并對其生物學活性進行了研究。本研究詳細闡述了TNRC6蛋白家族在RNA干擾過程中的作用。首先利用siRNA在不同的細胞系中敲低了TNRC6蛋白的表達,并檢測了其對小RNA在細胞內(nèi)源基因表達調(diào)控中的不同影響,包括小RNA介導的轉(zhuǎn)錄水平激活、轉(zhuǎn)錄水平抑制、可變剪接的影響以及miRNA介導的基因沉默等。本研究發(fā)現(xiàn),在這些不同的生物學過程中,只有AGO2是必不可少的,GW182/TNRC6A只參與了其中一部分生物學過程。此外,本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到了TNRC6A、TNRC6B和TNRC6AB等基因敲除細胞系,并利用蛋白質(zhì)譜、RNA測序等多種手段比較鑒定了不同基因敲除細胞系中差異基因及蛋白的表達,同時利用以上幾種基因敲除細胞系,較為系統(tǒng)的檢測了TNRC6蛋白在小RNA介導生物過程中的作用。本研究主要結(jié)果如下:(1)通過siRNA成功在多個哺乳動物細胞系中敲低了TNRC6基因表達,并檢測了其生物學作用。研究發(fā)現(xiàn),在miRNA介導的基因表達沉默、小RNA介導的轉(zhuǎn)錄水平激活、轉(zhuǎn)錄水平抑制和可變剪接等生物過程中,TNRC6蛋白參與了siRNA介導的轉(zhuǎn)錄水平激活基因表達和miRNA介導的基因沉默的部分過程。與之相比,AGO2在這些小RNA介導的基因表達調(diào)控中的作用更為重要。(2)利用CRISPR/Cas9技術(shù),成功獲得TNRC6A單基因敲除細胞系,TNRC6B單基因敲除細胞系和TNRC6AB雙基因敲除細胞系。在多次嘗試TNRC6蛋白家族(TNRC6ABC)三基因敲除失敗后,本研究發(fā)現(xiàn)TNRC6AB雙基因敲除已經(jīng)影響細胞的正常生長,因此認定TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C中至少有一個基因是維持細胞生長所必需的。所以本研究在TNRC6AB雙基因敲除的基礎上再次利用siRNA敲低TNRC6C的表達,以研TNRC6家族在細胞中的功能。并且在獲得敲除細胞系后,利用蛋白質(zhì)譜和qRT-PCR分別在蛋白和mRNA水平對目的基因進行了檢測,確定了目的基因的成功敲除。此外,本研究還通過免疫熒光對TNRC6A和AGO2在HCT116野生型和基因敲除型細胞中的表達進行了檢測,進一步確定基因的成功敲除。(3)利用以上基因敲除型細胞系,本研究對TNRC6影響RNA干擾因子在細胞胞質(zhì)和細胞核內(nèi)分布的作用進行了驗證,結(jié)果表明TNRC6蛋白只影響Dicer蛋白在細胞中的亞定位,對AGO2的分布沒有直接的影響。此后檢測了TNRC6在siRNA介導的胞質(zhì)內(nèi)mRNA的降解和細胞核內(nèi)長鏈非編碼RNA的降解中的作用,闡述了其在miRNA介導的基因沉默以及小RNA介導的轉(zhuǎn)錄水平激活過程中的影響。研究結(jié)果表明TNRC6并不直接作用于siRNA介導的基因沉默,卻在miRNA通路中具有非常重要的作用,并且其蛋白家族之間的作用是互補的。僅缺失TNRC6A或TNRC6B并不會影響miRNA通路的正常功能,同時缺失TNRC6A和TNRC6B對其有一定的影響,當對TNRC6AB雙基因敲除細胞系的TNRC6C進行敲低表達后,miR-34a在細胞中無活性,證明了TNRC6蛋白家族在miRNA通路中的重要作用。此外,只有TNRC6A參與了siRNA介導的基因轉(zhuǎn)錄,而TNRC6B和TNRC6C對該過程沒有顯著影響。(4)利用RNA-seq對不同基因敲除細胞系進行了基因差異表達分析。與野生型細胞HCT116相比,在TNRC6A~(-/-)細胞中,顯著上調(diào)的基因有1447個,并且上調(diào)基因主要富集分析中主要富集在細胞分化、形態(tài)、生長及蛋白定位等信號通路上,顯著下調(diào)的基因有1190個;TNRC6AB~(-/-)細胞中,有2710個基因顯著性上調(diào),有2750個顯著性下調(diào),并且大量上調(diào)基因主要富集在細胞分化、形態(tài)、生長及蛋白定位等信號通路上,下調(diào)基因主要富集在核糖體RNA、核糖體相關(guān)、線粒體相關(guān)的信號通路上;而在TNRC6B~(-/-)細胞中上調(diào)基因僅有270個,下調(diào)基因僅有156個。結(jié)果表明TNRC6B對細胞中基因表達的影響較小,而TNRC6A的作用則非常重要,但兩者具有相輔相成的作用效果。綜上所述,TNRC6在細胞的多個生物學過程中發(fā)揮著重要的作用。TNRC6參與了miRNA介導的基因表達沉默并且在該過程中起到?jīng)Q定性作用,該基因也參與了基因轉(zhuǎn)錄激活的部分過程。并且,本研究在多個層次對該基因以上功能進行了驗證,并通過RNA測序手段進一步證明了該基因在細胞生長過程中的重要性,為后期對TNRC6基因在動物細胞水平中的作用奠定了理論基礎。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

第一章 文獻綜述第一章 文獻綜述NRC6 蛋白家族胞胞質(zhì)中，小 RNA 可以調(diào)控基因的表達翻譯并控小 RNA 也可以調(diào)控基因的表達轉(zhuǎn)錄和可變剪接。蛋白 AGO2 (Argonaute 2)和 TNRC6A（Trinucleotid多種哺乳動物細胞的細胞核中被觀察到并檢測到(GNRC6A 是細胞核 RNAi 過程中的中心組織者，并ion 4)-NOT(negative on TATA-less)蛋白復合物、組互作用(Hicks et al. 2017)。

圖 1-2 GW182 在細胞中的功能(Niaz et al. 2018)Figure 1-2 Overview of the various functions of GW182 in the cell.小結(jié)NRC6 蛋白在細胞中參與了非常多且重要的生物學過程，足以證明這個。然而研究 TNRC6 蛋白的挑戰(zhàn)在于除了小 RNA 介導的基因沉默外，如在細胞中的具體生物學作用？如何找到更多的具有類似 GW 富集區(qū)的功且在哺乳動物細胞中不同亞種的 TNRC6 蛋白也需要被單獨研究。此外白如何被調(diào)控、他們的相互作用同伴以及他們在細胞中不同信號通路中是是十分重要且不容忽視的。NA干擾RNAi 簡介NA 干擾（RNAi）被認為是一種通過 microRNA (miRNAs)或小干擾As）調(diào)控靶基因 mRNA 穩(wěn)定性從而影響哺乳動物細胞質(zhì)中蛋白轉(zhuǎn)錄的

d Meister 2013)、Dicer(Bernstein et al. 2001)和 TAR RNA 結(jié)合蛋白（ et al. 2012; Takahashi et al. 2014; Wilson et al. 2013)。TNRC6 蛋白結(jié)A 復合體(Huntzinger et al. 2010)并將其導向靶基因 RNA，與此同時抑制蛋白翻譯過程的轉(zhuǎn)錄因子對蛋白表達進行調(diào)控(Djuranovic et a一種參與前體 miRNAs 剪切成成熟的雙鏈 miRNAs 過程的核糖核酸 干擾過程中，Dicer 和 TRBP 結(jié)合雙鏈 miRNAs 并協(xié)助引導鏈裝載于胞胞質(zhì)中 RNAi 過程具有十分重要的研究和應用價值。siRNAs 是一控制特定基因表達的重要手段，許多 siRNAs 已經(jīng)被用于治療癌癥等的臨床試驗中(Watts et al. 2012; Yang et al. 2012)。天然的和人工s 也被證實在哺乳動物細胞胞質(zhì)中能特異性干擾靶基因 RNA。有研以參與細胞核中的 RNAi 過程，并證明 AGO 和 TNRC6 蛋白等 RN細胞核中(Gagnon et al. 2014; Matsui et al. 2013; Robb et al. 2005)，這 干擾因子可能在細胞核中參與 RNA 轉(zhuǎn)錄和可變剪切。同時也有 與 AGO、 TNRC6 和 CCR4-NOT 蛋白也可以在細胞核形成有功能 et al. 2018)。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉文寶;;一種快速高質(zhì)量植物總RNA提取方法介紹[J];山東蔬菜;2007年02期

2 靳偉;張瑞芝;常翠芳;;環(huán)狀RNA及其生物學功能概述[J];生物學教學;2018年12期

3 孫暢;張朝霞;;環(huán)狀RNA研究進展[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2019年02期

4 苗嘉峰;馬小艮;裴卓;趙榮國;李玉紅;;特定環(huán)狀RNA表達與衰老的關(guān)系研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2019年01期

5 郭岱昀;;RNA藥物的研發(fā)現(xiàn)狀[J];中國處方藥;2019年02期

6 張沛;高春林;夏正坤;;環(huán)形RNA與相關(guān)疾病研究進展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2018年09期

7 李懷東;李昕澤;;小干擾RNA研究概況[J];世界最新醫(yī)學信息文摘;2019年35期

8 張碩;王非凡;劉洪臣;;環(huán)狀RNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究進展[J];口腔頜面修復學雜志;2019年05期

9 楊宗霖;王藝;馬田田;霍春月;劉曉;闞云超;李丹丹;;有翅和無翅豌豆蚜中翅型分化信號通路相關(guān)微小RNA及其靶基因的表達差異[J];昆蟲學報;2019年11期

10 鄭凌伶;戚益軍;屈良鵠;;走向國際科技前沿的中國RNA研究[J];中國科學:生命科學;2019年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張暢斌;尹愛華;何天文;王波;鄧文喻;賴有行;;一種經(jīng)濟便捷的手足口病原RNA提取方法[A];廣東省遺傳學會第九屆代表大會暨學術(shù)研討會論文及摘要匯編[C];2014年

2 李園園;陸俊梅;程松;崔振玲;;RNA恒溫擴增實時檢測技術(shù)鑒定鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌[A];第四屆中國臨床微生物學大會暨微生物學與免疫學論壇論文匯編[C];2013年

3 Jingrong Wang;Junping Kou;Hilda Yau;Wanrong Zong;Tongmeng Yan;Zhi-Hong Jiang;;Protective Effect and Sequences of RNA Fragments from Ginseng's Larger RNAs against Myocardial Ischemia Injury in Mice[A];中國化學會第十一屆全國天然有機化學學術(shù)會議論文集（第一冊）[C];2016年

4 郭曉強;張巧霞;黃衛(wèi)人;蔡志明;;長鏈非編碼RNA與腎細胞癌發(fā)生[A];遺傳多樣性：前沿與挑戰(zhàn)——中國的遺傳學研究（2013-2015）——2015中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2015年

5 吳建軍;李勛;黃錦坤;楊倜;徐益勤;楊巧媛;蔣義國;;環(huán)境化學物暴露血液非編碼RNA標志物研究[A];中國毒理學會第七次全國毒理學大會暨第八屆湖北科技論壇論文集[C];2015年

6 李成云;梁戈玉;姚文卓;隋靜;申嫻;張艷秋;馬書梅;尹立紅;浦躍樸;;胃癌相關(guān)長鏈非編碼RNA的鑒定及腫瘤標志物的篩選研究[A];中國毒理學會第七次全國毒理學大會暨第八屆湖北科技論壇論文集[C];2015年

7 徐勇;張付全;張克讓;Yin Yao Shugart;;精神分裂癥中轉(zhuǎn)錄因子-微小RNA交互調(diào)控網(wǎng)絡的異常[A];中華醫(yī)學會第十三次全國精神醫(yī)學學術(shù)會議論文匯編[C];2015年

8 韓艷華;陳紅印;張禮生;;RNA干擾技術(shù)在昆蟲滯育機制研究中的應用[A];植�？萍紕�(chuàng)新與農(nóng)業(yè)精準扶貧——中國植物保護學會2016年學術(shù)年會論文集[C];2016年

9 王小利;吳佳海;舒健虹;牟瓊;;高羊茅光周期調(diào)控基因RNA干擾表達載體構(gòu)建[A];中國草學會2013學術(shù)年會論文集[C];2013年

10 魏任雄;;長鏈非編碼RNA與男性不育的研究進展[A];中華中醫(yī)藥學會第十四次男科學術(shù)大會論文集[C];2014年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 中科院上海生科院上海植物生理生態(tài)所 毛穎波;尋找小RNA世界里的另一道風景[N];科學時報;2011年

2 本報記者 沈則瑾;破解環(huán)形RNA之謎[N];經(jīng)濟日報;2019年

3 記者 顏維琦;我科學家深度“解碼”環(huán)形RNA[N];光明日報;2019年

4 唐一塵;新“剪刀”能暫時編輯RNA[N];中國科學報;2019年

5 趙熙熙;實驗室“原始湯”生成RNA堿基[N];中國科學報;2019年

6 記者 黃辛;科學家實現(xiàn)活細胞RNA標記與無背景成像[N];中國科學報;2019年

7 記者 耿挺;RNA剪接基因編輯新方法[N];上�？萍紙�;2018年

8 記者 聶翠蓉;基因檢測“神探夏洛克”問世[N];科技日報;2017年

9 本報記者 聶翠蓉;讓RNA處理器在活細胞中“奔騰”[N];科技日報;2017年

10 記者 毛黎;脂質(zhì)分子可提高RNA干擾技術(shù)效率[N];科技日報;2009年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 孫振;CRISPR/Cas9技術(shù)介導的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2基因敲除及其功能研究[D];揚州大學;2019年

2 桑奔;長非編碼RNA調(diào)控腫瘤細胞耐藥及衰老的機制研究[D];中國科學技術(shù)大學;2019年

3 劉戀;RNA差異甲基化與共甲基化模式分析方法研究[D];西北工業(yè)大學;2018年

4 郭巍;山楂屬植物中蘋果褪綠葉斑病毒小RNA解析及其靶基因功能的研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學;2019年

5 劉中天;TNRC6對哺乳動物細胞中RNA干擾和基因表達調(diào)控的影響[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

6 王熵;siRNA的非對稱結(jié)構(gòu)對RNA干擾的影響研究[D];湖南師范大學;2016年

7 盧梅華;革蘭氏陽性菌RNA降解關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];浙江大學;2019年

8 張楊;RNA互作文本挖掘工具開發(fā)及應用研究[D];電子科技大學;2019年

9 靳建軍;長非編碼RNA SYISL對肌肉生長發(fā)育的影響及其分子機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2018年

10 龔朵;CCDC80下調(diào)血管平滑肌細胞LPL表達對動脈粥樣硬化的影響及機制[D];南華大學;2019年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 趙佳;玉米赤霉素響應的編碼RNA和長鏈非編碼RNA研究[D];揚州大學;2019年

2 喻景雯;基于概率模型的長非編碼RNA-疾病關(guān)聯(lián)關(guān)系預測方法研究[D];湘潭大學;2019年

3 羅準;環(huán)狀RNA circPTPRM對肝癌細胞生物學行為的影響及其臨床意義的研究[D];中國醫(yī)科大學;2019年

4 何俊豪;基于序列與結(jié)構(gòu)特征的RNA中IRES元件預測研究[D];南京航空航天大學;2018年

5 趙菊平;RNA溫度感應器調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌F1抗原表達機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2019年

6 曾昭萍;第一部分 緬甸輸入性Ⅰ型和Ⅱ型登革病毒的全基因組序列測定和分子特征分析 第二部分 多瘤病毒SV40來源的環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2019年

7 樂張慧;LncRNA及RNA m6A甲基化在肢端型黑色素瘤中發(fā)病機制的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2019年

8 朱慧娟;長鏈非編碼RNA ENST00000444488.1調(diào)控血管平滑肌細胞遷移的作用機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2019年

9 熊信果;光溫敏核不育水稻育性差異相關(guān)的小RNA分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2019年

10 楊真禎;非編碼RNA circRNA_100395結(jié)合miR-144-3p發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用[D];華南理工大學;2019年

本文編號：2825818