絞股藍(lán)屬(Gynostemma BL.)隸屬于葫蘆科(Cucurbitaceae),屬下包含2亞屬16種2變種,中國(guó)有2亞屬14種2變種,主要分布于東亞及東南亞地區(qū),在我國(guó)的主要分布范圍為長(zhǎng)江流域及其以南。因其具有極大的藥用價(jià)值,近年來(lái)受到許多國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們的重視。然而,野外調(diào)查發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)屬植物自然居群生長(zhǎng)的地理環(huán)境復(fù)雜,該屬物種在分化過(guò)程中形成了一系列的生態(tài)變異類型,而且多個(gè)物種間形態(tài)特征交叉、過(guò)渡現(xiàn)象嚴(yán)重,為基于形態(tài)學(xué)的絞股藍(lán)屬植物的分類和系統(tǒng)發(fā)育帶來(lái)挑戰(zhàn)。目前,人們對(duì)絞股藍(lán)屬植物的研究主要集中在化學(xué)成分及藥理藥性研究、形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)研究、基于少數(shù)分子標(biāo)記的系統(tǒng)進(jìn)化研究等方面,而對(duì)該屬植物的葉綠體基因組尚未報(bào)道,因此,構(gòu)建絞股藍(lán)屬物種的完整葉綠體基因組圖譜是很有必要的。本研究利用絞股藍(lán)屬植物的葉綠體全基因組(Complete Chloroplast Genome)和核基因組分型GBS(Genotyping-by-Sequencing)的數(shù)據(jù),并結(jié)合形態(tài)學(xué)的量化數(shù)據(jù)共同研究絞股藍(lán)屬物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和群體遺傳特征,揭示中國(guó)亞熱帶地區(qū)絞股藍(lán)自然居群的進(jìn)化和群體動(dòng)態(tài)歷史。本研究的主要結(jié)論如下:(1)通過(guò)對(duì)絞股藍(lán)葉綠體DNA進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序獲得了完整的絞股藍(lán)葉綠體基因組序列和圖譜。結(jié)果表明:雙鏈環(huán)狀的絞股藍(lán)葉綠體基因組大小為157,576 bp,總GC堿基含量為37.00%。共預(yù)測(cè)到139個(gè)功能基因,包括91個(gè)蛋白編碼基因,30個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因。該研究首次獲得絞股藍(lán)屬植物的完整葉綠體基因組序列,為絞股藍(lán)屬以及葫蘆科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究提供了很好的參考。(2)在對(duì)8個(gè)絞股藍(lán)屬物種完整葉綠體基因組的比較研究中發(fā)現(xiàn):絞股藍(lán)屬植物葉綠體具有經(jīng)典的四部分結(jié)構(gòu),即一個(gè)大單拷貝區(qū)LSC(平均長(zhǎng)度86,834 bp),一個(gè)小單拷貝區(qū)SSC(平均長(zhǎng)度18,649 bp)以及兩個(gè)相互間隔且反向互補(bǔ)的反向重復(fù)區(qū)IRa和IRb(平均長(zhǎng)度26,174 bp);每個(gè)葉綠體基因組均編碼133個(gè)基因,其中包括87個(gè)蛋白編碼基因,8個(gè)rRNA基因,37個(gè)tRNA基因和1個(gè)假基因infA�；蚪M在結(jié)構(gòu)、基因組成和順序上都很保守。通過(guò)對(duì)葉綠體基因組中3種長(zhǎng)重復(fù)序列和SSR的搜索,結(jié)果發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)屬葉綠體基因組序列中含有大量的重復(fù)序列,且大多數(shù)重復(fù)序列分布于基因間隔區(qū)和內(nèi)含子上。另外,綜合序列變異和mVISTA的研究表明,葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)CDS比非編碼區(qū)CNS保守,反向重復(fù)區(qū)IR比單拷貝區(qū)SC保守。屬內(nèi)物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究表明絞股藍(lán)屬可分為2個(gè)亞屬,其結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類一致。(3)對(duì)10個(gè)葫蘆科代表屬的物種的完整葉綠體基因組進(jìn)行比較分析,結(jié)果表明葫蘆科植物的葉綠體基因組相對(duì)保守,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且均未發(fā)生基因重排事件。選擇壓力分析表明在3個(gè)基因(accD,clpP和matK)中存在一些受選擇位點(diǎn),由這3個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)參與植物發(fā)育和能量轉(zhuǎn)化、葉綠體蛋白合成以及基因轉(zhuǎn)錄,可能在葫蘆科植物應(yīng)對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。葫蘆科的葉綠體基因組屬于GC缺失類型,而且在第三個(gè)密碼子位置上有較強(qiáng)的A/T偏好。本研究揭示了psbL基因中的一個(gè)非常規(guī)起始密碼子,即原本的起始密碼子ACG變成了AUG,這是由于RNA編輯引起的,它可以修飾突變,調(diào)節(jié)葉綠體基因的表達(dá),是植物葉綠體中的一種校正機(jī)制。系統(tǒng)發(fā)育樹(ML和BI)表明錐形果屬Gomphogyne,雪膽屬Hemsleya和絞股藍(lán)屬Gynostemma構(gòu)成葫蘆科中最早分化的譜系。因此,我們的研究結(jié)果表明,葉綠體基因組數(shù)據(jù)可以有效地解決葫蘆科內(nèi)不同屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。此外,該研究可為今后的系統(tǒng)發(fā)育研究提供潛在的分子標(biāo)記和DNA條形碼,并為豐富葫蘆科葉綠體基因組資源做出巨大貢獻(xiàn)。(4)本研究利用量化的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和分子基因組層面的完整葉綠體基因組和GBS(Genotyping-by-Sequencing)基因分型的分析對(duì)絞股藍(lán)屬植物13種2變種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了深入探討,結(jié)果證實(shí)絞股藍(lán)屬下包含2個(gè)亞屬,即絞股藍(lán)亞屬和喙果藤亞屬。翅莖絞股藍(lán)、廣西絞股藍(lán)和扁果絞股藍(lán)應(yīng)從絞股藍(lán)亞屬內(nèi)移出,歸入喙果藤亞屬。而毛絞股藍(lán)、毛果絞股藍(lán)、緬甸絞股藍(lán)和大果絞股藍(lán)應(yīng)合并為“毛絞股藍(lán)”,并且可與長(zhǎng)梗絞股藍(lán)、光葉絞股藍(lán)和絞股藍(lán)進(jìn)行歸并,作為一個(gè)廣義的“絞股藍(lán)”物種對(duì)待。Beast分化時(shí)間的計(jì)算發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)屬的分化始于早第三紀(jì)晚期(23.02 Ma),屬內(nèi)亞屬的分化時(shí)間在中新世時(shí)期(12.75 Ma),而屬內(nèi)物種的分化主要集中在第三紀(jì)上新世末期與第四紀(jì)更新世初期(3Ma)。末次間冰期(0.13 Ma)時(shí),絞股藍(lán)屬植物主要分布在東亞?wèn)|南部地區(qū),當(dāng)末次冰期(0.02 Ma)來(lái)臨,絞股藍(lán)亞屬的分布范圍逐漸西移至內(nèi)陸,到達(dá)橫斷山區(qū)和秦嶺大巴山區(qū),而喙果藤亞屬的分布范圍在本地收縮,形成各自避難所;冰期過(guò)后的擴(kuò)散過(guò)程中可能存在雜交和遺傳漂變,從而形成現(xiàn)今物種的系統(tǒng)關(guān)系和分布格局。另外,本研究中基于SNP數(shù)據(jù)對(duì)絞股藍(lán)屬植物進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)屬植物可劃分為東西部?jī)蓚�(gè)分區(qū),我們推測(cè),在絞股藍(lán)屬各物種的形成和擴(kuò)散過(guò)程中,受到了強(qiáng)烈的地理環(huán)境和氣候條件的影響。(5)最后,本研究首次從基因組水平探討了絞股藍(lán)不同地理居群的種群遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明,絞股藍(lán)的居群遺傳多樣性低(He=0.175,Ho=0.183),居群間分化程度較高(F_(ST)=0.984),且遺傳變異主要存在于居群間。30個(gè)居群可以分為南北兩個(gè)分組,而在青藏高原東南邊緣、云貴高原和秦嶺-巴山地區(qū)的居群在進(jìn)化歷史上存在一定的基因交流。總之,本研究通過(guò)絞股藍(lán)屬植物葉綠體基因組的構(gòu)建,對(duì)該屬內(nèi)物種和其近緣屬(葫蘆科代表屬)部分物種的葉綠體基因組進(jìn)行了比較分析,并結(jié)合核基因組分型和量化的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)深入討論了絞股藍(lán)屬植物的系統(tǒng)分類與進(jìn)化關(guān)系。另外,還利用簡(jiǎn)化基因組數(shù)據(jù)分析探討了該屬植物的群體遺傳進(jìn)化和動(dòng)態(tài)歷史,加深人們對(duì)絞股藍(lán)屬分子遺傳背景的了解,并為東亞地區(qū)植物的保護(hù)提供有效信息。
【學(xué)位單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S567.237;Q943
【部分圖文】：

Read1 Read2 Allount（#） 977165 977165 1954330ount（bp） 293149500 293149500 58629900 Length（bp） 300 300 300unt（bp） 218862782 171126968 38998975tio（%） 74.66 58.38 67.516358unt（bp） 253912610 216727964 47064057tio（%） 86.62 73.93 80.776309unt（bp） 285585187 273485514 55907070tio（%） 97.42 93.29 95.399691t（bp） 58108 102245 160353（%） 0.02 0.03 0.000274體基因組組裝注釋裝獲得一條長(zhǎng)度為 157,576 bp 的序列，總 CG 含量為 37.00%（圖

西北大學(xué)博士畢業(yè)論文裝結(jié)果比對(duì)到 NT 數(shù)據(jù)庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)該序列與甜瓜（C. melo subsp. melo）完因組較為相似，其次為黃瓜（Cucumis sativus）和棒果木（Corynos）（圖 2.2），以上 3 個(gè)物種均為葫蘆科植物。，我們以甜瓜為參考基因組（JF412791），與獲得的絞股藍(lán)基因組作比較下圖 2.3。圖中的點(diǎn)基本在一條直線上，每一條線代表一條 scaffold，紅色藍(lán)色為反向比對(duì)。結(jié)果表明樣本中所有基因組序列均能較好的比對(duì)到參考絞股藍(lán)葉綠體基因組與甜瓜葉綠體基因組極為相似。

23（C. melo）葉綠體基因組為參考的絞股藍(lán)葉綠體基因組比對(duì)equence identity plot comparing the G. pentaphyllum chloroplastC. melo as a reference by using mummerplot.

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2824576