發(fā)布時(shí)間：2020-09-19 21:39

　　 半胱氨酸蛋白酶是一類含有半胱氨酸殘基活性中心并受巰基反應(yīng)基不可逆抑制的蛋白水解酶,在病毒、真菌、原生動(dòng)物植物、哺乳動(dòng)物中廣泛分布。除了基本的蛋白分解代謝功能外,還參與生理疾病、抗原呈遞以及其他重要的生命活動(dòng)的信號(hào)傳遞等。本研究基于前期高通量測序結(jié)果,篩選出三個(gè)潛在的多功能半胱氨酸蛋白酶CA分支C1家族組織蛋白酶基因:TccatB25、TccatL11和TccatL13。并且以赤擬谷盜為模式昆蟲對(duì)組織蛋白酶基因在免疫、生殖、胚胎及胚后幼蟲發(fā)育等功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行初步探究。除此之外,本研究鑒定了隸屬于半胱氨酸蛋白酶CD分支C13家族的編碼糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)酰胺酶催化亞基的基因TcPigK在昆蟲生長發(fā)育中的功能,且利用RNA-seq對(duì)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)行探究,并得到以下結(jié)果:時(shí)期表達(dá)模式顯示:TccatB25、TccatL11和TccatL13基因在赤擬谷盜的各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。TccatB25在晚期幼蟲表達(dá)量最高。TccatL11在晚期蛹中表達(dá)量最高。而TccatL13在晚期成蟲表達(dá)量最高。組織表達(dá)模式顯示:TccatB25在頭部表達(dá)量最高,其次為觸角、腸以及血淋巴。TccatL11則在血淋巴中表達(dá)量最高,其次在頭部;TccatL13只在腸中高表達(dá)。TccatB25、TccatL11和TccatL13在赤擬谷盜幼蟲中被大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在不同時(shí)間點(diǎn)所誘導(dǎo)。這暗示該三個(gè)基因參與免疫過程。并且,注射dscatB25、ds-catL11、ds-catL13后,免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Rel、Jnk和Stat92E,以及下游免疫效應(yīng)基因抗菌肽的mRNA表達(dá)量被顯著的抑制。其中注射dscatB25后,抗菌肽Att2、Def1、Cec1的轉(zhuǎn)錄水平被抑制;注射ds-catL11、dscatL13后,除Att3外所有抗菌肽的轉(zhuǎn)錄水平都被抑制53%以上。除此之外,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌刺激赤擬谷盜幼蟲后72小時(shí),TccatB25、TccatL11和TccatL13敲減組幼蟲死亡率顯著高于對(duì)照組。暗示TccatB25、TccatL11和TccatL13可能通過Rel、Jnk和Stat92E正調(diào)控抗菌肽的表達(dá)參與免疫功能。利用RNAi敲低TccatB25、TccatL11和TccatL13的表達(dá)量,胰島素通路中FoxO、ToR、4EBP、Pi3k、Akt的mRNA水平發(fā)生不同趨勢的變化。并且解剖和生殖實(shí)驗(yàn)顯示,注射ds-catB25、ds-catL11、ds-catL13會(huì)使生殖腺發(fā)生不同程度發(fā)育畸形的表型,進(jìn)而影響卵室和精巢瓣的平均寬度,抑制雌蟲產(chǎn)卵量。除此之外,注射ds-catL11、ds-catL13還會(huì)導(dǎo)致部分卵不能孵化及部分卵孵化后胚后幼蟲發(fā)育不良兩種表型。暗示TccatB25、TccatL11和TccatL13可能通過胰島素通路參與生殖、胚胎及胚后幼蟲發(fā)育的功能。赤擬谷盜TcPigK進(jìn)入號(hào)為TC009622,位于7號(hào)染色體(LG7)上。全長克隆結(jié)果顯示TcPigK mRNA全長1299 bp,具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。ORF(開放性閱讀框)為1017bp,編碼388個(gè)氨基酸。在對(duì)TcPigK蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示:TcPigK具有信號(hào)肽序列、肽酶C13家族結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)天冬氨酰-連接的糖基化位點(diǎn)。進(jìn)一步多序列比對(duì)顯示,赤擬谷盜TcPigK蛋白不僅具有哺乳動(dòng)物中半胱氨酸蛋白酶C13家族保守的半胱氨酸和組氨酸催化活性位點(diǎn),并且具有洋刀豆Legumain的活性位點(diǎn)。時(shí)期表達(dá)顯示TcPigK在各個(gè)發(fā)育時(shí)期都穩(wěn)定表達(dá);組織表達(dá)顯示TcPigK在大部分器官或組織中均有表達(dá),但脂肪體的相對(duì)表達(dá)量最高。在幼蟲期系統(tǒng)性干擾TcPigK后,赤擬谷盜在晚期蛹會(huì)出現(xiàn)完全致死效應(yīng)。在蛹期系統(tǒng)性干擾TcPigK后,赤擬谷盜在成蟲期會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖缺陷并完全抑制產(chǎn)卵行為。為了明確TcPigK的作用機(jī)制,我們對(duì)對(duì)照組和TcPigK敲低組的RNA樣本進(jìn)行RNA高通量測序分析。在RNA-seq數(shù)據(jù)中,我們篩選到了382個(gè)差異表達(dá)基因,211個(gè)上調(diào),171個(gè)下調(diào)。在382個(gè)差異表達(dá)基因中,一共有254個(gè)能被注釋到GO條目三大功能群中的49個(gè)GO條目。在這些功能群體中,蛋白水解、幾丁質(zhì)代謝過程和防御反應(yīng)是跟TcPigK的功能密切相關(guān)的。差異表達(dá)基因KEGG通路分析顯示有7條通路為顯著富集差異表達(dá)基因。這7條通路包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、丙酮酸鹽代謝、檸檬酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝、鈣離子代謝、二羧酸酯和二羧酸酯代謝和苯丙氨酸代謝。暗示TcPigK與昆蟲表皮幾丁質(zhì)的形成與胞內(nèi)各種物質(zhì)與能量代謝的功能密切相關(guān)。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述肽酶催化的保守活性位點(diǎn)：Cys25 和 His159。除織蛋白酶結(jié)構(gòu)的重要的氨基酸殘基：用于形成“催化的 His 位點(diǎn)形成咪唑環(huán) Asn175[8, 9]。后來 的分離純化使其晶體結(jié)構(gòu)的全面解析成為可能。圖 1.1）：組織蛋白酶的成熟形式由 L 和 R 兩個(gè) 3 個(gè)α螺旋（藍(lán)色）；R 位于右側(cè)，是與前鏈（片（紅色）所形成的一種螺旋結(jié)構(gòu)。而其保守的則位于結(jié)合的兩個(gè)域的頂端開口處（黃色棒狀標(biāo)

維持組織形態(tài)的功能喪失將會(huì)導(dǎo)致心血管等各組織細(xì)胞退行性大量擴(kuò)增，進(jìn)而引起腹主動(dòng)脈瘤（Abdominal aortic aneurysms，AAA）和動(dòng)脈粥樣硬化（Atherogenesis）等人類疾病和癌細(xì)胞的擴(kuò)散[12, 13]。而在小鼠彈性蛋白灌注誘導(dǎo)的 AAA 模型中顯示，一旦 CatL、K 和 S 的功能缺失，都會(huì)使動(dòng)脈壁中彈性蛋白的降解減少，進(jìn)而緩解疾病的發(fā)生[14]。2、組織蛋白酶與細(xì)胞自噬。細(xì)胞自噬（Autophagy）過程是指一些功能失調(diào)的細(xì)胞器和受損蛋白被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體（Autophagosome）包裹后，與動(dòng)物溶酶體融合形成自溶酶體，利用其中的水解酶進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用。越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞的自噬在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中對(duì)細(xì)胞生存和死亡的調(diào)控中起重要的作用。在特定的細(xì)胞刺激環(huán)境下，細(xì)胞自噬可以保護(hù)細(xì)胞遠(yuǎn)離細(xì)胞毒性[15, 16]。因此，細(xì)胞自噬可以維持組織穩(wěn)態(tài)確保細(xì)胞在應(yīng)激條件下存活[17]。細(xì)胞自噬的失調(diào)已在神經(jīng)退行性疾病、心臟病、癌癥和衰老等多種疾病的發(fā)病機(jī)制中得到證實(shí)[18-22]。

圖 1.3 哺乳動(dòng)物 GPI-APs的結(jié)構(gòu)（引自[62]）物為例，GPI-APs 由 GPI 部分和特定蛋白兩部分組脂質(zhì)和膜外多糖部分組成，由于 GPI 具有兩條的飽富集分布于細(xì)胞膜富含脂筏的區(qū)域（圖 1.3）。其中 心 骨 架 ： EtNP-6Man,1-2Man,1-6Man,1-4GlcN,1并且其可以通過側(cè)枝修飾。核心多糖骨架包含 1 ine phosphate, EtNP），3個(gè)甘露糖（Mannose, Man）ine, Glc）[63]。其中，在很多 GPI-APs 中，與 EtN的 Man1 是常見的，而α1-2 連接到 Man3 側(cè)枝上，而接到 Man1 只在某些 GPI-APs 中發(fā)現(xiàn)[62]。

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本文編號(hào)：2823023