基因島常是水平基因轉(zhuǎn)移的產(chǎn)物,側(cè)翼帶有兩條正向重復(fù)序列,內(nèi)部靠近邊界處常常含有可移動基因。根據(jù)其功能可分為致病島、多重抗生素抗性島、重金屬離子抗性島、適應(yīng)性島和分泌島等。由于基因島含有可移動基因和邊界正向重復(fù)序列,使得基因島可以從菌株中環(huán)出,并且通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式轉(zhuǎn)移到其他的菌株中。本實驗的研究材料鮑氏不動桿菌是一種多重耐藥菌,對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類藥物、四環(huán)素和氯霉素等同時耐藥,給臨床治療上帶來極大的困難。至今為止,僅在一部分鮑氏不動桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)含有耐藥性基因的基因島,整合在ATP酶(comM)基因中,正向重復(fù)序列為5'-ACCGC-3'。本研究為了更廣泛研究鮑氏不動桿菌中各種類型的基因島,首先要對其基因島進(jìn)行預(yù)測,而應(yīng)用于基因島預(yù)測的軟件中,絕大多數(shù)預(yù)測軟件不能提供基因島的正向重復(fù)序列。但正向重復(fù)序列或其附近的反向重復(fù)序列是其內(nèi)部可移動基因的作用位點。本研究利用自主開發(fā)的軟件GIPredictor建立73個鮑氏不動桿菌基因島的數(shù)據(jù)庫,確保每個基因島內(nèi)部至少含有一個可移動基因,側(cè)翼帶有兩條清晰的正向重復(fù)序列。本研究選擇19個整合酶,通過手動預(yù)測的方法預(yù)測出16類整合位點的基因島,與數(shù)據(jù)庫中的結(jié)果一致,并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在73個鮑氏不動桿菌基因島的數(shù)據(jù)庫中,根據(jù)正向重復(fù)序列出現(xiàn)的概率最大的方法,預(yù)測出基因島共2783個,其中包含整合酶和重組酶的基因島共764(27.45%)個;根據(jù)正向重復(fù)序列與可移動基因距離最近的方法,預(yù)測出基因島共3406個,其中包含整合酶和重組酶的基因島共916(26.89%)個。手動預(yù)測的16類整合位點的基因島,分別整合在6S RNA、tmRNA、tRNA、結(jié)構(gòu)基因中以及轉(zhuǎn)錄的間隔序列(兩類不同的間隔序列)中。其中,tRNA基因包括tRNA-Arg、tRNA-Gly、tRNA-Leu、tRNA-Val和tRNA-Ser基因,結(jié)構(gòu)基因包括tRNA二氫尿苷合成酶A(tRNA dihydrouridine synthase A,dusA)、tRNA二氫尿苷合成酶B(tRNA dihydrouridine synthase B,dusB)、天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)、鄰氨基苯甲酸合成酶亞基(Anthranilate synthase subunit,AS)、假尿苷合成酶(Pseudouridine synthase,PUS)、MFS轉(zhuǎn)運蛋白(MFStransporter,MFST)以及與tamB蛋白家族相似的一類蛋白(tamB-like)。其中6S RNA、AK、AS、PUS、MFST和tamB-like是鮑氏不動桿菌基因島中新發(fā)現(xiàn)的整合位點。整合在6S RNA位點的基因島共65個,其中串聯(lián)基因島為9個。整合在tmRNA位點的基因島共55個,有10個為串聯(lián)基因島。整合在tRNA-Val位點的基因島中,還發(fā)現(xiàn)了1個串聯(lián)基因島。在tmRNA、tRNA-Arg、tRNA-Gly、tRNA-Leu、tRNA-Ser、dusA和AS位點都發(fā)現(xiàn)了種外的同源基因島。本研究使用軟件MEGA7.0對16類整合位點的基因島所包含的整合酶進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,再結(jié)合在線網(wǎng)站ClustalW、EMBOSS EXPLORER、軟件RNAstructure 6.0.1和SeqnConverter等分析預(yù)測各類基因島中整合酶對應(yīng)正向重復(fù)序列的作用位點,包括酶切位點和綁定位點,發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)基因島中整合酶與其攜帶的正向重復(fù)序列是相互匹配的關(guān)系。本研究希望通過對鮑氏不動桿菌基因島數(shù)據(jù)庫的建立及其結(jié)構(gòu)的分析,能為臨床上對于其耐藥性方面的實驗研究提供數(shù)據(jù)支持,也為將來基因島的轉(zhuǎn)移實驗和功能鑒定方面奠定分子基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q933
【部分圖文】：

章 建立鮑氏不動桿菌基因島數(shù)據(jù)庫 上海師范大學(xué)碩士學(xué) 試驗方法.1 軟件 GIPredictor 預(yù)測鮑氏不動桿菌相關(guān)的基因島使用軟件 GIPredictor 對 73 個鮑氏不動桿菌進(jìn)行基因島的預(yù)測，首先3 個菌株完整的核酸序列進(jìn)入 DoubleACT 進(jìn)行序列比對，自動下載比對存，隨后對目標(biāo)基因組中的可移動基因進(jìn)行篩選，其篩選可移動基因的結(jié)果，以數(shù)據(jù)出現(xiàn)頻率最高的方法（命名為 V1）和數(shù)據(jù)離酶最近的方 V2）兩種方式，計算基因島的正向重復(fù)序列，最后生成基因島結(jié)果的，軟件操作流程如圖 2-1 所示。其軟件基于比較基因組學(xué)的方法，用計規(guī)定正向重復(fù)序列中不相同的單堿基數(shù)不得超過 3 個，不得有兩個連續(xù)基。從而保證所預(yù)測的基因島側(cè)翼帶有清晰的正向重復(fù)序列，并且在基部至少包含一個可移動基因（整合酶、重組酶或轉(zhuǎn)座酶）。

并整理鮑氏不動桿菌潛在可移動的基因島數(shù)據(jù)庫 NCBI，獲得 73 個鮑氏不動桿菌的核酸序基因組注釋文件的所有整合酶（大小> 310aa）中源性<70%）（表 3-2）。根據(jù)候選整合酶在基因組00 bp 以內(nèi)分別查找存在的位點（表 3-2），包括 者轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列（400 bp）。當(dāng)該位點上發(fā)現(xiàn)個基因或 400 bp 序列用作候選子序列。否則，選序列的基因或轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)序列作為候選子序列mannii MDR-ZJ06、A. baumannii AbH12O-A2 和 子序列以及 2 kb 的上游和下游序列，與其余 7atch Scores (1, -2)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中沒有整合基因島的陰性菌株和整合了基因島的陽島的邊界正向重復(fù)序列，并試圖將邊界序列向外不連續(xù)的單堿基不匹配（圖 3-1）。將所預(yù)測的基

GI6SRNA整合酶的遺傳進(jìn)化分析

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本文編號：2816039