脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又名嘔吐毒素(vomitoxin,VT),是一種污染谷物嚴(yán)重且廣泛存在的單端孢菌霉菌毒素,主要是鐮刀菌屬產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物,對人類和動物產(chǎn)生復(fù)雜的毒性作用。研究表明DON誘導(dǎo)由ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認為是導(dǎo)致細胞死亡和凋亡的機制之一。酵母細胞壁提取物(Yeast cell wall extract,YCWE)由葡聚糖、甘露聚糖和糖蛋白組成,是一類抗氧化、抗炎、增強免疫、促生長和改善動物腸道環(huán)境的天然物質(zhì)。目前,YCWE用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)研究較多,但在毒素干預(yù)方面尚未有深入研究。本實驗以豬腸上皮細胞(1PEC-J2)為細胞模型,探究DON對IPEC-J2細胞的毒性機制及YCWE對細胞的保護效應(yīng)的機制。1.DON的細胞毒性及YCWE對其毒性干預(yù)的研究:以IPEC-J2細胞為研究對象,構(gòu)建腸上皮細胞損傷模型,研究DON的毒性效應(yīng);同時探究YCWE對低濃度DON(1 μmol/L)細胞毒性的干預(yù)作用。從DON和YCWE對細胞活性、細胞形態(tài)、抗氧化及抗炎效果給予評價。結(jié)果如下:1)MTS測腸上皮細胞活性方面:DON以劑量和時間依賴性方式使細胞活性顯著降低;而加入YCWE作用12-36h后DON的細胞毒性降低。2)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)方面:1 μmol/L DON作用不同時間后細胞形態(tài)被破壞,36 h后出現(xiàn)漂浮和貼壁不緊的細胞,而YCWE與DON共同處理細胞12、24和36 h后,YCWE明顯抑制DON對1PEC-J2細胞形態(tài)的損傷,維持細胞的正常形態(tài)。3)ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中炎性因子方面:1 μmol/L DON處理細胞12 h和24 h后,炎性因子IL-6、IL-8、IL-1p和TNF-α均呈現(xiàn)增加的趨勢。與DON組相比,添加YCWE后各炎性因子的含量發(fā)生不同程度的變化。4)氧化指標(biāo)方面:1 μmol/L DON處理細胞12 h和24 h后,顯著增加MDA和ROS的水平,降低GSH的含量。同樣激光共聚焦顯微鏡分析顯示,DON處理細胞24 h后,細胞內(nèi)ROS含量也呈現(xiàn)顯著增加的趨勢,CPDT和YCWE均能夠顯著抑制ROS的生成。用YCWE處理被DON損傷的IPEC-J2細胞,胞內(nèi)的MDA和ROS含量下調(diào),GSH上調(diào)。以上結(jié)果表明,1μmol/L DON顯著降低細胞活性,形態(tài)被破壞,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生;YCWE逆轉(zhuǎn)了此濃度下DON的細胞毒性,并維持細胞的正常形態(tài),具有抗炎和抗氧化的作用。2.DON誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬以及YCWE干預(yù)DON細胞毒性的分子機制:由于氧化應(yīng)激是細胞凋亡和自噬的重要因素,因此本研究開展了 DON作用濃度和時間對自噬的影響,建立DON誘導(dǎo)自噬的模型。探究DON對自噬和凋亡影響的同時,探討YCWE對1 μmol/L DON誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡的影響。結(jié)果顯示:1)DON能夠激活自噬,并上調(diào)凋亡蛋白Bax的表達,但隨著作用濃度及時間的增加,自噬程度減弱。YCWE與1μmol/LDON共同處理IPEC-J2細胞后,YCWE顯著抑制DON誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡的發(fā)生。2)利用3-MA、Rap分別作為自噬相關(guān)通路的抑制劑和激活劑,研究自噬是否涉及DON對細胞的毒性以及YCWE是否通過調(diào)控自噬對細胞具有保護作用。①細胞活性結(jié)果表明,3-MA和YCWE均使DON損傷的細胞活力顯著增加,Rap使細胞活性顯著降低。②氧化指標(biāo)結(jié)果顯示,3-MA和YCWE均顯著抑制DON誘導(dǎo)的MDA和ROS的上調(diào),抑制GSH下調(diào),Rap使ROS和MDA顯著上調(diào),GSH下調(diào)。③Western blot檢測自噬和凋亡蛋白的表達水平顯示,3-MA和YCWE明顯逆轉(zhuǎn)了 DON的自噬誘導(dǎo)作用且下調(diào)了由DON引起的細胞凋亡。結(jié)果表明,DON誘導(dǎo)細胞自噬和凋亡,且DON通過誘導(dǎo)細胞自噬促使細胞凋亡,YCWE則可能是通過下調(diào)DON誘導(dǎo)的自噬抑制凋亡的發(fā)生。3.ROS-PI3K-AKT-mTOR信號通路在低濃度DON誘導(dǎo)的自噬及YCWE調(diào)控自噬中的作用:由于DON誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和自噬,ROS負調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號通路,但ROS-PI3K-AKT-mTOR信號通路是否直接參與調(diào)控DON誘導(dǎo)的自噬及YCWE干預(yù)DON誘導(dǎo)的細胞損傷,并不為我們所知。因此本研究開展了以IPEC-J2為研究對象,1 μmol/LDON單獨或與抗氧化通路激活劑(CPDT)、PI3K激活劑(740 Y-P)、PI3K抑制劑(LY294002)、YCWE聯(lián)合處理細胞12 h,檢測IPEC-J2細胞活性、自噬和PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達水平,以證明氧化應(yīng)激和PI3K-AKT-mTOR信號通路均參與DON誘導(dǎo)的自噬及DON誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號通路,從而進一步證明DON細胞毒性及YCWE干預(yù)DON細胞毒性的分子機制。結(jié)果如下:1)細胞活性結(jié)果顯示,CPDT、YCWE和740Y-P均能使細胞活性顯著增加,LY294002使細胞活性顯著降低。2)氧化應(yīng)激參與DON誘導(dǎo)的自噬結(jié)果顯示,CPDT使自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ蛋白明顯降低,同時P62蛋白表達水平顯著增加。3)PI3K-AKT-mTOR信號通路參與DON誘導(dǎo)的自噬結(jié)果顯示,DON使P-AKT/AKT和P-mTOR/mTOR均顯著降低。LY294002使LC3-Ⅱ蛋白明顯上調(diào),P62蛋白表達顯著下調(diào),同時P-AKT/AKT和P-mTOR/mTOR下調(diào);740Y-P與LY294002結(jié)果呈現(xiàn)相反的趨勢。4)DON誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號通路結(jié)果顯示,DON使P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR 均顯著降低。CPDT 使 P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR均顯著增加。5)ROS-PI3K-AKT-mTOR通路參與YCWE干預(yù)DON誘導(dǎo)的細胞自噬結(jié)果顯示,DON 使 P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR 均顯著降低。YCWE 使 P-AKT/AKT 和P-mTOR/mTOR均顯著增加。綜上結(jié)果表明,1 μmol/L DON誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是通過調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬而使凋亡信號通路被激活表現(xiàn)出細胞毒性,而YCWE則可通過抗氧化使PI3K-AKT-mTOR信號通路激活而抑制自噬起到保護細胞的作用。
【學(xué)位單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.3
【部分圖文】：

噬是在不同壓力下促進細胞存活的內(nèi)穩(wěn)態(tài)降解的細胞內(nèi)過程。然而，自噬還可能逡逑通過過度的“自我消化”導(dǎo)致細胞死亡，被稱為“自噬性細胞死亡”［５２］。逡逑自嗤分子過程如圖１．２，微管相關(guān)蛋白輕鏈３邋（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ邋ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１逡逑ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ邋３，ＬＣ３）是哺乳動物Ａｔｇ８蛋白同源體，被Ａｔｇ４切割以暴露Ｃ－末端甘逡逑氨酸殘基，被定義為胞質(zhì)可溶性ＬＣ３－Ｉ形式；在Ａｔｇ３和Ａｔｇ７的作用下ＬＣ３－Ｉ的逡逑Ｃ末端甘氨酸殘基與a愔Ｒ掖及罰ǎ校瑁錚螅穡瑁幔簦椋洌歟澹簦瑁幔睿錚歟幔恚椋睿澹校牛┳漢閑緯懾義希蹋茫常桑桑校�，睔gㄒ邐蹋茫常桑尚問劍⑶遙蹋茫常桑山裘艿畝ㄎ揮謐允商宓哪諭餑ゅ義仙锨也斡胱允膳菽さ難由歟親允商逯と諍系墓丶街瑁郟擔(dān)常荊擔(dān)矗蕁＃穡叮駁鞍�，也称辶x銜櫻眩櫻裕停保＜諍卸嚳核鼗鞍拙奐宓陌逯�。Ｐ６骥为现^擁鞍子脲義隙嗑鄯核鼗孜錁奐褰岷喜⒂耄蹋茫常桑桑校漚岷�，吞寿牑延伸并封闭为吞寿犃x義嚇菪緯勺允尚√

本文編號：2812871