【摘要】：細(xì)胞自噬是一類依賴于溶酶體和液泡的降解途徑,在真核生物中高度保守。植物細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí),首先在自噬相關(guān)蛋白的催化作用下,細(xì)胞內(nèi)形成包裹靶物質(zhì)的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體,再進(jìn)一步將自噬小體運(yùn)送到液泡內(nèi)進(jìn)行降解,產(chǎn)生新的小分子以供機(jī)體重新利用。在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、干旱、高鹽等非生物脅迫以及病原菌入侵等生物脅迫下,植物可以通過自噬這一高度精細(xì)復(fù)雜的降解機(jī)制回收細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)和損壞的細(xì)胞器以維持自身的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和生存。自噬能誘導(dǎo)酵母細(xì)胞液泡酸化,以維持自噬小體降解所需水解酶的活性。與酵母類似,植物囊泡H~+-ATPase(V-ATPase)是一類定位在液泡膜和分泌膜系統(tǒng)上的質(zhì)子泵,其主要功能是利用催化ATP水解產(chǎn)生的能量向液泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)氫離子,使液泡酸化。研究表明,V-ATPase特異性抑制劑ConcanamycinA(ConcA)能抑制內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌途徑以及自噬小體的降解,暗示了V-ATPase在植物自噬過程中起著非常重要的作用。擬南芥V-ATPase是由12個(gè)亞基組成的復(fù)合體,但目前對(duì)于單個(gè)亞基在自噬中的生理生化功能仍不清楚。擬南芥V-ATPase亞基C(AtVHA-C)由單基因編碼,其點(diǎn)突變體det3-1的TGN/EE酸化能力變?nèi)?TGN到液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)速率變緩,但高爾基體和液泡的酸化能力不受影響。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),AtVHA-C缺陷型突變體det3-1可能也是一個(gè)自噬缺陷型突變體。因此,本文系統(tǒng)研究了AtVHA-C的組織表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位,以及突變體det3-1在碳饑餓和氮饑餓環(huán)境下的生理功能和作用機(jī)理,旨在揭示V-ATPase亞基C參與植物自噬的功能,并獲得以下結(jié)果:1.RT-PCR和GUS組織定位染色結(jié)果表明,AtVHA-C在擬南芥幼苗、下胚軸、葉片、花以及果莢中普遍表達(dá)。煙草葉片細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示,AtVHA-C主要定位在膜、微絲、細(xì)胞核。2.與野生型相比,突變體對(duì)于氮饑餓和碳饑餓更加敏感。氮饑餓處理后,det3-1葉片細(xì)胞死亡嚴(yán)重,葉片中ROS積累;碳饑餓處理后,det3-1全部死亡,det3-1四周齡苗黑暗處理3 d時(shí)ROS開始積累。3.與野生型相比,突變體中自噬小體的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程被顯著影響。蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)結(jié)果顯示,氮饑餓處理后,det3-1中ATG8蛋白呈先增后減趨勢(shì)。氮饑餓處理16 h后,用轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦活細(xì)胞成像系統(tǒng)(Spin Disc)檢測(cè)ATG8e-GFP/det3-1中自噬小體的形成情況,結(jié)果表明det3-1根成熟區(qū)自噬小體數(shù)目與野生型中接近,但是加入ConcA后det3-1根成熟區(qū)自噬小體比野生型中少。將ATG8e-GFP/det3-1氮饑餓處理0 d、1 d、2 d后,Western Blot檢測(cè)ATG8e-GFP融合蛋白和游離GFP蛋白的變化情況,結(jié)果顯示,氮饑餓處理后det3-1中游離GFP蛋白含量基本保持不變。碳饑餓處理后,det3-1根成熟區(qū)中自噬小體的數(shù)目是野生型中的0.5倍,加入ConcA后det3-1根成熟區(qū)自噬小體數(shù)目與野生型中的接近。黑暗處理后det3-1中ATG8蛋白含量變化趨勢(shì)與野生型接近。4.突變體中自噬相關(guān)基因和潛在的自噬通路相關(guān)基因表達(dá)量被顯著改變。將det3-1氮饑餓處理0 d、2 d后提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因以及一些可能與自噬通路相關(guān)基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)氮饑餓除了影響自噬相關(guān)基因ATG2、ATG8a、ATG18a的表達(dá),乙烯合成相關(guān)基因ACS2、ACS8和ABA相關(guān)基因SAG113的表達(dá)也受到影響。用外源脫落酸(ABA)和乙烯合成前體物質(zhì)ACC處理,結(jié)果顯示det3-1子葉綠化受到ABA影響,但ACC對(duì)det3-1的萌發(fā),子葉綠化和根長(zhǎng)都沒有影響。綜上所述,本研究利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)的方法,探究了氮饑餓和碳饑餓對(duì)擬南芥det3-1突變體蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的影響,確定det3-1為自噬缺陷型突變體。為后期深入研究V-ATPase亞基C參與自噬的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為全面認(rèn)知自噬機(jī)制和V-ATPase的生理功能提供了新思路與理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q942
【圖文】：

但有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中 rRNA 翻轉(zhuǎn)可能依賴于自噬途徑（Bassham et al.,2016）；（6）蛋白酶體自噬(Proteaphagy)：是最初發(fā)現(xiàn)于擬南芥中的一類新型的選擇性自噬機(jī)制，通過蛋白酶體自噬能水解未激活的 26S 蛋白酶復(fù)合體。泛素化降解普遍存在于蛋白酶體降解和自噬降解途徑中，因此蛋白酶體降解與自噬之間可能存在密切聯(lián)系。研究證明，蛋白酶體自噬降解發(fā)生于氮饑餓時(shí)的非選擇性自噬途徑或蛋白酶體抑制劑存在下條件下的選擇性自噬途徑。例如，饑餓誘導(dǎo)的非選擇性蛋白酶體自噬依賴于 ATG1 激酶，而且可能受 TOR 信號(hào)元件的調(diào)控（R.S. Marshal et al., 2015）。過去十多年中，關(guān)于自噬核心機(jī)制的探索，以及自噬在脅迫響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育中的作用等方面的研究已經(jīng)取得重大進(jìn)步。此外，還鑒定出一些參與自噬的非ATG 蛋白。關(guān)于自噬調(diào)節(jié)的研究也正在進(jìn)行，TOR 激酶復(fù)合體可能是重要的自噬調(diào)節(jié)子。自噬相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的鑒定對(duì)于自噬機(jī)制的探究有重要意義，也進(jìn)一步說明自噬與激素、脅迫等信號(hào)途徑之間的聯(lián)系（Ping Wang et al., 2018）。因此，關(guān)于自噬調(diào)控的分子機(jī)制的探究是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

州大學(xué)碩士論文 擬南芥 V-ATPase 亞基 C 參與自噬的機(jī)制clv det3-1 雙突表現(xiàn)出細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)缺陷，莖破裂導(dǎo)致內(nèi)部組織暴露，維管織不發(fā)達(dá)，細(xì)胞壁較薄。推測(cè)，莖的破裂可能是由于細(xì)胞增殖和膨脹失衡所clv 突變體促進(jìn)細(xì)胞增殖，而 det3-1 抑制細(xì)胞膨脹。但 det3-1 與 clvdet3-1 的子和葉片并無差異。說明 det3-1 背景下 clv 的突變主要影響莖的表型，對(duì)其他器基本無影響（Ali Ferjani et al., 2015）。

大學(xué)碩士論文 擬南芥 V-ATPase 亞基 C 參與自噬的機(jī)第三章 結(jié)果與分析1 VHA-C 可能起源于低等植物和高等植物分化的早期本文以擬南芥 V-ATPase 的亞基 C 為研究對(duì)象，首先通過氨基酸序列比不同物種間 VHA-C 蛋白的同源關(guān)系。分別選取了動(dòng)物中的小鼠（Mm.）植物萊茵衣藻（Cr.），蘚類植物小立碗蘚（Pp.），雙子葉植物大豆（Gm茄（Sl.）、棉花（Gr.），以及單子葉植物玉米（Zm.）、水稻（Os.）、大麥（H分析蛋白進(jìn)化樹可知（圖 3-1），動(dòng)物、植物的 VHA-C 蛋白之間距離較于不同的類群，藻類、蘚類植物與單子葉、雙子葉植物之間距離較遠(yuǎn)，雙物與單子葉植物之間距離較近。所以，VHA-C 可能起源于低等植物和高分化的早期。

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本文編號(hào)：2801171