【摘要】：來源于桔青霉的核酸酶P1隸屬于核酸酶S1/P1家族,其家族成員中的核酸酶P1和核酸酶S1均是單鏈特異性核酸酶,能夠催化單鏈DNA或RNA生成核苷酸,生成的5’-核苷酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于制藥、食品和核酸結(jié)構(gòu)的研究中。在生物制藥方面,其可用于制造各種生化藥物。在食品保健方面,在酵母自溶過程中添加核酸酶P1促進(jìn)RNA轉(zhuǎn)變?yōu)?’-GMP及5’-AMP的速率,這兩種物質(zhì)是制作各種食品調(diào)味劑的原料。在核酸研究方面,核酸酶P1的主要功能有促進(jìn)核酸結(jié)構(gòu)的研究和堿基組成的分析。目前國內(nèi)核酸酶P1供不應(yīng)求,核酸酶P1的生產(chǎn)菌主要為桔青霉,而桔青霉生產(chǎn)的核酸酶P1具有純度不高,雜蛋白過多且有毒素?fù)诫s影響后續(xù)的分離純化等問題。核酸酶P1異源表達(dá)的宿主有大腸桿菌和酵母細(xì)胞,表達(dá)的核酸酶P1活力較低。而本研究在黑曲霉中實(shí)現(xiàn)了核酸酶P1的高效重組表達(dá),并將其應(yīng)用于核苷酸的生產(chǎn)中。本文以一株低蛋白背景的無孢黑曲霉Bdel4(LB3ang02D4,在黑曲霉SH-2菌株基礎(chǔ)上敲除了糖化酶glaA、淀粉酶aamA、An05g02100和An12g06930)為宿主菌,構(gòu)建了不同表達(dá)策略的核酸酶P1的黑曲霉表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化黑曲霉篩選出了一株核酸酶P1表達(dá)最優(yōu)的轉(zhuǎn)化子,發(fā)酵酶液經(jīng)His親和層析純化后,進(jìn)行了核酸酶P1酶學(xué)性質(zhì)的研究,并探索了其在核苷酸的生產(chǎn)中的應(yīng)用。主要研究的內(nèi)容如下:(1)根據(jù)Uniprot公布的NP1的蛋白序列,經(jīng)過密碼子優(yōu)化后人工合成Nuc P1基因。將6xHis標(biāo)簽加在Nuc P1基因的C末端,以用于后續(xù)的His親和層析獲得核酸酶P1的純酶液。構(gòu)建采用Kexlinker(糖化酶自帶的信號(hào)肽切割位點(diǎn))、2A肽、融合蛋白等不同表達(dá)策略的核酸酶P1的表達(dá)框,基于同源重組原理定點(diǎn)整合核酸酶P1的表達(dá)框到黑曲霉基因組糖化酶glaA基因位置、18S rDNA和28S rDNA的多拷貝位置,通過測定轉(zhuǎn)化株的酶活水平篩選出酶活最高的一株黑曲霉轉(zhuǎn)化株Bpnu-18S-2,其發(fā)酵至144 h時(shí)酶活達(dá)到89.2 U/mL。(2)通過His親和層析純化重組核酸酶P1菌株產(chǎn)生的發(fā)酵液,純化后核酸酶P1的分子量大小為38kDa,之后用糖苷酶PNGase F去糖基化后得到核酸酶P1大小為30 kDa,與PDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測的核酸酶P1分子量一致�；诩兓玫暮怂崦窹1研究其酶學(xué)性質(zhì),測定得到重組核酸酶P1反應(yīng)最適pH為5.3,最適溫度為65°C,加入2 mmol/L的Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)能夠提高核酸酶P1的酶活,同時(shí)也顯著提高了核酸酶P1的耐熱性,Ni~+約降低20%酶活力,但卻能提高核酸酶P1的耐熱性,K~+、EDTA使核酸酶P1的酶活力約降低40%。將黑曲霉轉(zhuǎn)化株Bpnu-18S-2的發(fā)酵上清液加入酵母自溶體系中以提高核苷酸的產(chǎn)量,添加75 U的核酸酶P1可生產(chǎn)出14.13 mg/mL的核苷酸,比不添加核酸酶P1時(shí)產(chǎn)生的單位核苷酸的產(chǎn)量提高了4.51 mg/mL。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78
【圖文】：

生命最基本的物質(zhì)之一，是一種由許多核苷酸組成的生物大分子化組成成分不同可分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。，傳遞遺傳信息。RNA 是蛋白質(zhì)合成的過程中的主要原料。其中類，第一是核糖體占比最大的物質(zhì)—核糖體 RNA（rRNA，占 80%NA（tRNA，占 15%），是蛋白質(zhì)合成過程的搬運(yùn)工；第三種是信占 5%），作為模板用于合成蛋白質(zhì)。[1,2]的水解產(chǎn)物—核苷酸全水解的產(chǎn)物有四種（嘌呤、嘧啶、戊糖、磷酸），其均屬于堿性可產(chǎn)生核苷酸。核苷酸的組成方式為核苷分子中戊糖上的醇羥基分子堿基的成分不同分為四類：5’-腺嘌呤核苷酸（AMP），5’-），5’-胞嘧啶核苷酸（CMP），5’-尿嘧啶核苷酸（UMP）[3-5]（

圖 1-1 核酸酶 P1 活性中心結(jié)構(gòu)圖re1-1 Schematic diagram of the active site of nuclease P性質(zhì)性質(zhì)被廣泛研究，總結(jié)在表 1-1。如前所述，盡相同。核酸酶的分子大小在 13 kDa-46 kDa 酸酶 SNase 是一種依賴于 Ca2+、分泌于胞外的能夠耐受一定濃度范圍的強(qiáng)酸。來源于米曲霉其功能為水解單鏈 DNA 和 RNA 并應(yīng)用于分析的核酸酶 P1 含有 270 個(gè)氨基酸，分子量大小為 29.227 kDa。N-糖基化（N-linked glycosylation天冬酰胺-XXX（任一種氨基酸）-絲氨酸/蘇氨位和表達(dá)以及酶的穩(wěn)定性與活性均有著顯著作

圖 1-2 核酸酶 P1 的糖基化位點(diǎn)分析Fig 1-2 Analysis for N-Glycosylation sites of nuclease P1表 1-1 常用核酸酶理化性質(zhì)Table 1-1 Properties of some nuclease名稱 最適溫度 最適 pH MW（kDa） 研究者脫氧核糖核酸酶Ⅰ60℃ 7-8 31 kDa Kunitz[14]， Salniko核酸酶 P1 65-70℃ 5-6 44-46 kDa 蓋宏偉[16]，婁永江[1SNase - - 16.8 kDa 徐立東[18],宋吉奎[峰[20]核酸酶 S1 35℃ 4.2 32 kDa Volker M. Vogt[21]

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2795992