【摘要】：輸出載體PIN1(PIN-FORMED1)是生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)從生成部位運(yùn)輸?shù)阶饔貌课坏闹饕ぞ咧?與植物的生長(zhǎng)發(fā)育尤其是葉原基的起始與排列密切相關(guān)。本研究以擬南芥、金魚(yú)草等基因組數(shù)據(jù)為依據(jù)設(shè)計(jì)特異引物,采用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)從大巖桐獲得SsPIN1基因cDNA全長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行了基因序列分析;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行了SsPIN1基因的組織表達(dá)模式分析和SsPIN1基因?qū)Σ煌に靥幚砗蟮捻憫?yīng)分析;利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了SsPIN1蛋白的亞細(xì)胞定位以及磷酸化位點(diǎn)突變對(duì)其極性定位的影響;并通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法將SsPIN1基因?qū)霟煵軸R-1獲得抗性植物。主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)同源克隆結(jié)合RACE方法獲得大巖桐SsPIN1基因cDNA全長(zhǎng)序列1770bp。該序列編碼的蛋白質(zhì)包含589個(gè)氨基酸,分子量為64772.92道爾頓,等電點(diǎn)為8.074。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,大巖桐SsPIN1蛋白與金魚(yú)草的AmPIN1a的親緣關(guān)系最近。進(jìn)一步序列比對(duì)結(jié)果顯示,SsPIN1蛋白由較為保守的羧基端和氨基端以及包含300個(gè)左右氨基酸的長(zhǎng)親水環(huán)(hydrophilic loop,HL)構(gòu)成。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示SsPIN1定位于質(zhì)膜(plasma membrane,PM)。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示,SsPIN1蛋白羧基端有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,氨基端有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于膜運(yùn)輸?shù)鞍准易?IPROO4776)中植物運(yùn)輸載體家族(IRRO14024)。2.利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)SsPIN1基因進(jìn)行組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),該基因在大巖桐盛花期地上所有組織中均有表達(dá)。其中在幼葉葉柄中的表達(dá)量最高,花瓣與腋芽次之。利用外源激素NAA處理大巖桐幼苗后,SsPIN1基因的表達(dá)水平隨處理時(shí)長(zhǎng)的增加呈先上升再下降趨勢(shì);利用BA、GA等外源激素處理后,SsPIN1基因表達(dá)水平隨處理時(shí)長(zhǎng)的增加表現(xiàn)為上升趨勢(shì)。3.利用激光共聚焦顯微鏡觀察SsPIN1蛋白亞細(xì)胞定位表明,該蛋白定位在質(zhì)膜上。進(jìn)一步構(gòu)建SsPIN1蛋白T228、T249、T287磷酸化位點(diǎn)的單點(diǎn)突變,雙突和三突后,發(fā)現(xiàn)該蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生了明顯改變。突變后的SsPIN1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的趨勢(shì)增加。其中,單點(diǎn)突變對(duì)SsPIN1的極性定位影響較小,三點(diǎn)突變對(duì)SsPIN1的極性定位影響最大。這表明磷酸化位點(diǎn)突變對(duì)SsPIN1極性定位的影響具有疊加效應(yīng)。4.基于in fusion方法構(gòu)建了pBI111L-SsPIN1過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法將SsPIN1基因?qū)霟煵軸R-1并進(jìn)行Kan抗性篩選�？剐灾仓瓯憩F(xiàn)為生長(zhǎng)變緩、根系發(fā)生受到抑制等相關(guān)表型。PCR檢測(cè)抗性植株nptII基因均呈陽(yáng)性。進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn),SsPIN1基因在煙草抗性植株中的表達(dá)水平顯著升高。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2791397