【摘要】：輸出載體PIN1(PIN-FORMED1)是生長素在植物體內(nèi)從生成部位運輸?shù)阶饔貌课坏闹饕ぞ咧?與植物的生長發(fā)育尤其是葉原基的起始與排列密切相關(guān)。本研究以擬南芥、金魚草等基因組數(shù)據(jù)為依據(jù)設(shè)計特異引物,采用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)從大巖桐獲得SsPIN1基因cDNA全長。在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行了基因序列分析;采用實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行了SsPIN1基因的組織表達(dá)模式分析和SsPIN1基因?qū)Σ煌に靥幚砗蟮捻憫?yīng)分析;利用激光共聚焦顯微鏡檢測了SsPIN1蛋白的亞細(xì)胞定位以及磷酸化位點突變對其極性定位的影響;并通過葉盤轉(zhuǎn)化法將SsPIN1基因?qū)霟煵軸R-1獲得抗性植物。主要研究結(jié)果如下:1.通過同源克隆結(jié)合RACE方法獲得大巖桐SsPIN1基因cDNA全長序列1770bp。該序列編碼的蛋白質(zhì)包含589個氨基酸,分子量為64772.92道爾頓,等電點為8.074。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,大巖桐SsPIN1蛋白與金魚草的AmPIN1a的親緣關(guān)系最近。進(jìn)一步序列比對結(jié)果顯示,SsPIN1蛋白由較為保守的羧基端和氨基端以及包含300個左右氨基酸的長親水環(huán)(hydrophilic loop,HL)構(gòu)成。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示SsPIN1定位于質(zhì)膜(plasma membrane,PM)�？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示,SsPIN1蛋白羧基端有5個跨膜結(jié)構(gòu)域,氨基端有4個跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于膜運輸?shù)鞍准易?IPROO4776)中植物運輸載體家族(IRRO14024)。2.利用實時定量PCR對SsPIN1基因進(jìn)行組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),該基因在大巖桐盛花期地上所有組織中均有表達(dá)。其中在幼葉葉柄中的表達(dá)量最高,花瓣與腋芽次之。利用外源激素NAA處理大巖桐幼苗后,SsPIN1基因的表達(dá)水平隨處理時長的增加呈先上升再下降趨勢;利用BA、GA等外源激素處理后,SsPIN1基因表達(dá)水平隨處理時長的增加表現(xiàn)為上升趨勢。3.利用激光共聚焦顯微鏡觀察SsPIN1蛋白亞細(xì)胞定位表明,該蛋白定位在質(zhì)膜上。進(jìn)一步構(gòu)建SsPIN1蛋白T228、T249、T287磷酸化位點的單點突變,雙突和三突后,發(fā)現(xiàn)該蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生了明顯改變。突變后的SsPIN1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的趨勢增加。其中,單點突變對SsPIN1的極性定位影響較小,三點突變對SsPIN1的極性定位影響最大。這表明磷酸化位點突變對SsPIN1極性定位的影響具有疊加效應(yīng)。4.基于in fusion方法構(gòu)建了pBI111L-SsPIN1過表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將SsPIN1基因?qū)霟煵軸R-1并進(jìn)行Kan抗性篩選�？剐灾仓瓯憩F(xiàn)為生長變緩、根系發(fā)生受到抑制等相關(guān)表型。PCR檢測抗性植株nptII基因均呈陽性。進(jìn)一步通過實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn),SsPIN1基因在煙草抗性植株中的表達(dá)水平顯著升高。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2791397