【摘要】：磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用,其能夠水解胞內(nèi)第二信使cAMP(環(huán)磷酸腺苷),從而終止cAMP所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能。目前,在大多數(shù)真菌中報道的磷酸二酯酶家族包含了高親和性磷酸二酯酶(pde2/pdeH)和低親和性磷酸二酯酶(pdel/pdeL),它們在真菌的營養(yǎng)菌絲生長和致病性發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。捕食線蟲真菌的代表菌株-寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrys oligospora)在饑餓條件下產(chǎn)生三維菌網(wǎng)(three-dimensional networks)作為捕食器官捕捉線蟲為自身生長獲取營養(yǎng),但是捕食器官形成的信號調(diào)控機制還不清楚。本論文以寡孢節(jié)叢孢中與構(gòu)巢曲霉等絲狀真菌同源的高親和性磷酸二酯酶(AoPdeH,AOL s00083g160)和低親和性磷酸二酯酶(AoPdeL,AOL s00097g378)為研究對象,對磷酸二酯酶編碼基因進行敲除,探究磷酸二酯酶在寡孢節(jié)叢孢營養(yǎng)菌絲生長和致病性發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能。主要實驗結(jié)果:1.磷酸二酯酶的功能結(jié)構(gòu)域和聚類分析對寡孢節(jié)叢孢兩種磷酸二酯酶的功能結(jié)構(gòu)域分析表明,AoPdeH含有以下的保守結(jié)構(gòu)域和位點:3'5'-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶超家族結(jié)構(gòu)域(IPR036971)、磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)域(IPR003607)、3'5'-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶催化結(jié)構(gòu)域(IPR002073)和3'5'-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶保守位點(IPR023174);AoPdeL也含有多個保守結(jié)構(gòu)域,包括是富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域超家族(IPR032675)、核糖核酸酶Z/羥基�；入赘孰乃饷笜�(IPR036866)和cAMP磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)域(IPR000396)。聚類分析表明,AoPdeH和AoPdeL分別聚類于2個不同進化分支上,由此可以初步推斷這兩個蛋白在真菌中可能發(fā)揮著不同的作用。2.磷酸二酯酶敲除突變株的營養(yǎng)菌絲生長、抗逆性和致病性分析利用同源重組技術(shù)對兩種磷酸二酯酶編碼基因進行敲除,成功獲得兩種磷酸二酯酶基因的敲除突變株,對突變株的菌絲形態(tài)、生長速率、抗逆境脅迫能力、殺線蟲能力、胞外蛋白酶活性以及三維菌網(wǎng)形態(tài)和數(shù)量進行了統(tǒng)計比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AoPdeH基因的缺失造成其突變株生長速率顯著減慢、氣生菌絲出現(xiàn)缺陷、菌絲橫膈膜增多且發(fā)生膨大變形、對環(huán)境壓力敏感性增強,除此之外,ΔAoPdeH突變株失去形成成熟三維菌網(wǎng)的能力,殺線蟲能力顯著降低但并沒有完全喪失殺線蟲能力,對其發(fā)酵液進行蛋白酶活性分析,發(fā)現(xiàn)突變株胞外蛋白酶活性沒有明顯變化。然而,ΔAoPdeL突變株的生長速率、抗逆境脅迫能力與寡孢節(jié)叢孢野生型菌株相比沒有顯著差異,殺線蟲能力和產(chǎn)生三維菌網(wǎng)數(shù)量有所下降,菌絲形態(tài)有膨大變形現(xiàn)象。以上實驗結(jié)果表明AoPdeH參與了寡孢節(jié)從孢的菌絲生長、抗逆性和致病性發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程的調(diào)控。3.磷酸二酯酶參與產(chǎn)孢過程的調(diào)控產(chǎn)孢量比較發(fā)現(xiàn),ΔAoPdeH突變株分生孢子產(chǎn)量僅為野生型菌株孢子產(chǎn)量的2～6%,ΔAoPde 突變株的分生孢子產(chǎn)量與野生型菌株相比無顯著差異。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),兩種磷酸二酯酶基因突變株孢子形態(tài)皆發(fā)生變形,變得狹長無橫膈膜,除此之外ΔAoPdeH突變株分生孢子梗的數(shù)量明顯少于野生型菌株,且孢子梗上幾乎沒有孢子著生,ΔAoPdeL突變株分生孢子梗數(shù)量及孢子著生方式與寡孢節(jié)叢孢野生型菌株相比無明顯差異。為進一步探討磷酸二酯酶對產(chǎn)孢的調(diào)控作用,選取13個產(chǎn)孢調(diào)控基因在產(chǎn)孢初期(3 days)、產(chǎn)孢中期(5 days)和孢子成熟期(7 days)進行熒光定量PCR分析,結(jié)果表明,ΔAoPdeH突變株13個產(chǎn)孢調(diào)控基因中FlbA、Acr1、FluG、VelB、NsdD、FlbC、PkaC1、Plp1、AbaA、LreA和LreB的轉(zhuǎn)錄水平皆下調(diào),而在分生孢子產(chǎn)量與野生型菌株沒有明顯差異的ΔAoPdeL突變株中,13個產(chǎn)孢調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平與野生型菌株相比無明顯變化。以上實驗結(jié)果表明AoPdeH參與了寡孢節(jié)叢孢的產(chǎn)孢過程的調(diào)控。4.磷酸二酯酶參與寡孢節(jié)叢孢菌絲內(nèi)cAMP水平調(diào)控通過酶聯(lián)免疫法測定突變株營養(yǎng)菌絲生長和致病性發(fā)育過程中不同時間點的菌絲內(nèi)cAMP含量,結(jié)果表明,在所選取的所有時間點ΔAoPdeH敲除株和ΔAoPdeL敲除株菌絲內(nèi)cAMP含量均高于寡孢節(jié)叢孢野生型菌株。為進一步分析磷酸二酯酶對cAMP水平的調(diào)控機制,選取16個磷酸二酯酶上下游的關(guān)鍵基因以及參與調(diào)節(jié)cAMP含量的相關(guān)基因進行熒光定量PCR(RT-PCR)分析,其中cAMP受體樣蛋白和cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白、腺苷酸環(huán)化酶表達量發(fā)生了明顯變化(在菌絲生長發(fā)育期間顯著上調(diào),致病性發(fā)育期間顯著下調(diào)),說明磷酸二酯酶可能通過調(diào)控上述基因的表達水平從而參與寡孢節(jié)叢孢cAMP含量的調(diào)節(jié)。本文的創(chuàng)新點:1.首次在寡孢節(jié)叢孢中成功敲除了磷酸二酯酶家族的蛋白編碼基因,發(fā)現(xiàn)AoPdeH參與寡孢節(jié)從孢營養(yǎng)菌絲生長、無性產(chǎn)孢、抗逆境脅迫壓力、捕食器官形成和菌絲內(nèi)cAMP含量調(diào)節(jié)等重要生物學(xué)過程的調(diào)控。2.通過RT-PCR比較了AoPdeH、AoPdeL、分生孢子發(fā)育調(diào)控以及cAMP合成等相關(guān)基因在ΔAoPdeH突變株、ΔAoPdeL突變株和野生型菌株中不同時間點的轉(zhuǎn)錄水平變化,推測磷酸二酯酶參與寡孢節(jié)叢孢中分生孢子的發(fā)育以及cAMP合成等相關(guān)基因的表達調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

在大部分真核生物中異源三聚體Ｇ蛋白的信號傳導(dǎo)是通過利用ｃＡＭＰ邋（ｃｙｃｌｉｃ逡逑ＡＭＰ）作為第二信使來介導(dǎo)細胞外刺激從而對細胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)組分的轉(zhuǎn)導(dǎo)［２５］。逡逑己經(jīng)發(fā)現(xiàn)ｃＡＭＰ信號級聯(lián)的組分（圖１－３）在各種真菌中是高度保守的信號傳導(dǎo)模逡逑塊，其影響和調(diào)節(jié)真核生物在生長、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過程中的一系列基本細胞過逡逑程。而響應(yīng)配體刺激的ＧＰＣＲ，通過膜錨定的腺苷酸環(huán)化酶形成了許多空間分離的逡逑ｃＡＭＰ產(chǎn)生源頭，在響應(yīng)于細胞外刺激后，在整個細胞中就有多個ｃＡＭＰ源點被逡逑激活，導(dǎo)致ｃＡＭＰ的穩(wěn)態(tài)水平的逐漸積累，在達到臨界閾值濃度時，ｃＡＭＰ可以逡逑進一步激活幾種重要的效應(yīng)物（最重要的是ＰＫＡ

逡逑圖１－２寡孢節(jié)叢孢捕器形成的調(diào)控模型［１３１逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｔｒａｐ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ逡逑３邋ｃＡＭＰ信號級聯(lián)研究進展逡逑在大部分真核生物中異源三聚體Ｇ蛋白的信號傳導(dǎo)是通過利用ｃＡＭＰ邋（ｃｙｃｌｉｃ逡逑ＡＭＰ）作為第二信使來介導(dǎo)細胞外刺激從而對細胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)組分的轉(zhuǎn)導(dǎo)［２５］。逡逑己經(jīng)發(fā)現(xiàn)ｃＡＭＰ信號級聯(lián)的組分（圖１－３）在各種真菌中是高度保守的信號傳導(dǎo)模逡逑塊，其影響和調(diào)節(jié)真核生物在生長、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過程中的一系列基本細胞過逡逑程。而響應(yīng)配體刺激的ＧＰＣＲ，通過膜錨定的腺苷酸環(huán)化酶形成了許多空間分離的逡逑ｃＡＭＰ產(chǎn)生源頭，在響應(yīng)于細胞外刺激后，在整個細胞中就有多個ｃＡＭＰ源點被逡逑激活，導(dǎo)致ｃＡＭＰ的穩(wěn)態(tài)水平的逐漸積累，在達到臨界閾值濃度時，ｃＡＭＰ可以逡逑進一步激活幾種重要的效應(yīng)物（最重要的是ＰＫＡ，一種ｃＡＭＰ依賴性蛋白激酶Ａ），逡逑進而介導(dǎo)廣泛的下游生理效應(yīng)［２６１逡逑４逡逑

Ｃｏｍｐｕｔｅ邋ｐＩ／Ｍｗ邋ｔｏｏｌ分析表明，ＡｏＰｄｅＨ蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點分另（Ｊ為逡逑８５．３邋ｋＤａ和６．３７。利用Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ和ＢＬＡＳＴ對寡孢節(jié)叢孢ＡｏＰｄｅＨ蛋白的結(jié)構(gòu)逡逑域進行了分析，結(jié)果如下（圖２－１、２），其含有一個３’５＇－環(huán)核苷酸磷酸二酯酶超家逡逑族結(jié)構(gòu)域（ＩＰＲ０３６９７１）、一個磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)域（ＩＰＲ００３６０７）、一個３’５’－環(huán)核逡逑苷酸磷酸二酯酶催化結(jié)構(gòu)域（ＩＰＲ００２０７３）和３’５’－環(huán)核苷酸磷酸二酯酶保守位點逡逑（ＩＰＲ０２３１７４）。逡逑Ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ，邋ｃｌｉｃｋ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｂｅｌｏｗ邋ｆｏｒ邋ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ｒｅｓｕｌｔｓ．逡逑１邐１２５邐２Ｓ？邐３７５邐ｓｏｔ邐６２Ｓ邐ｍ逡逑，邋，逡逑Ｋ？２＋邋ｂｉｎ４ｉｎ？邋ｓｉｔ＊逡逑Ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｈｉｔｓ邐ＰＤＥａｓｅ＿Ｉ．逡逑Ｓｕｐｅｒｆａｎｉｌｉｅｓ邐ＨＯｃ邋ｓｕｐｅｒ－Ｔａｍｉ邋ｌｙ逡逑圖２－１邋ＡｏＰｄｅＨ蛋白的比對分析逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｂｌａｓｔ邋ａ

【參考文獻】

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本文編號：2791628