【摘要】：耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)對氧化和冷凍等脅迫具有極強(qiáng)的耐受性,大量實(shí)驗(yàn)表明,以無規(guī)卷曲為二級結(jié)構(gòu)的類分子伴侶蛋白LEA3參與到該菌的抗逆過程。前期研究表明,耐輻射異常球菌的類分子伴侶蛋白DohL屬于LEA3蛋白家族,具有LEA3蛋白家族的特征,即含有8個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的保守基序(motifs),但與已報(bào)道的以無規(guī)卷曲為二級結(jié)構(gòu)的LEA3蛋白完全不同,DohL蛋白能夠形成以α-螺旋為主的天然有序的二級結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)的有序性可能與其抗逆功能以及耐輻射異常球菌適應(yīng)極端環(huán)境有關(guān)。本研究利用定點(diǎn)突變的方法降低DohL蛋白二級結(jié)構(gòu)的有序性,通過測定圓二色譜,構(gòu)建重組大腸桿菌菌株以及回補(bǔ)菌株,闡明DohL蛋白有序性與抗逆性的關(guān)系。主要研究進(jìn)展如下:1.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),DohL蛋白N端序列(1-103位)為Deinococcus屬保守序列,可能是其折疊成有序二級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵區(qū)域。分析結(jié)果顯示,亮氨酸(L)、色氨酸(W)和異亮氨酸(I)位點(diǎn)高度保守,且上述3種氨基酸能夠促成蛋白形成有序二級結(jié)構(gòu)。因此,本研究將61位的W和75位的I突變?yōu)楦彼?P),該突變蛋白命名為WIP,將14-17位4個(gè)連續(xù)L、61位的W和75位的I突變?yōu)镻,該突變蛋白命名為LWIP。軟件預(yù)測突變后的2個(gè)蛋白有序性均降低,與DohL蛋白相比,有序性從高到低依次為DohLWIPLWIP。進(jìn)一步利用圓二色譜技術(shù)測定DohL及突變蛋白二級結(jié)構(gòu)的有序性,結(jié)果顯示,3個(gè)蛋白的有序性分別為DohL:82.5%;WIP:62.2%;LWIP:51.4%,有序性與預(yù)測結(jié)果一致。2.構(gòu)建重組大腸桿菌進(jìn)行蛋白異源表達(dá)和表型分析,在氧化和冷凍脅迫條件下,表達(dá)突變蛋白的重組菌株比表達(dá)DohL蛋白的重組菌生存能力減弱。為進(jìn)一步研究蛋白保護(hù)能力的變化,體外分別表達(dá)并純化了DohL、WIP和LWIP 3個(gè)蛋白,同時(shí)測定DohL及2個(gè)突變蛋白在反復(fù)凍融和H_2O_2沖擊條件下對LDH(乳酸脫氫酶)的保護(hù)作用。體外酶活實(shí)驗(yàn)表明,以上3種蛋白在脅迫條件下均能保護(hù)LDH的活性,具有類分子伴侶功能,保護(hù)作用強(qiáng)弱程度為DohLWIPLWIP,表明DohL蛋白保護(hù)作用隨有序性降低而減弱。3.為驗(yàn)證DohL及2個(gè)突變蛋白的抗逆功能,構(gòu)建了3個(gè)回補(bǔ)菌株Com-dohl、Com-wip、Com-lwip,并進(jìn)行高濃度H_2O_2脅迫處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3個(gè)回補(bǔ)株均能夠不同程度回補(bǔ)突變株耐受氧化脅迫的能力,且3個(gè)回補(bǔ)株的回補(bǔ)能力強(qiáng)弱為Com-dohlCom-wipCom-lwip,說明DohL蛋白的抗逆功能隨有序性降低而減弱,進(jìn)而導(dǎo)致菌株氧化脅迫抗性減弱。進(jìn)一步測定菌株體內(nèi)總抗氧化能力,測定在80 mM H_2O_2處理?xiàng)l件下野生型、突變株及回補(bǔ)株體內(nèi)總抗氧化能力。結(jié)果表明,Com-wip和Com-lwip回補(bǔ)株相比Com-dohl回補(bǔ)株總抗氧化能力減弱,說明DohL蛋白有序性降低影響其抗逆功能,進(jìn)而降低菌株氧化脅迫抗性,由此推測,高度保守位點(diǎn)上的氨基酸對DohL蛋白的抗逆功能具有重要作用。綜上所述,耐輻射異常球菌DohL蛋白N端區(qū)域是該蛋白有序折疊的關(guān)鍵區(qū)域,DohL蛋白的抗逆功能隨蛋白的有序性降低而減弱。研究結(jié)果說明耐輻射異常球菌中氨基酸的組成和比例有利于DohL蛋白結(jié)構(gòu)的正確折疊和抗逆功能的發(fā)揮,可能是菌株適應(yīng)極端環(huán)境的結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936
【圖文】：

圖 1.1AcLEA 蛋白在不同濃度 TFE 的條件下 CD 光譜ectra of AcLEA at different concentrations of trifluoroethanol (TF算數(shù)據(jù)得出，隨 TFE 濃度增加至 66 %時(shí)，螺旋結(jié)構(gòu)例相對減少（圖 1.2）。但進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，AcLEA變，只有在誘導(dǎo)劑 TFE 條件下才會形成以 α-螺旋為

圖 1.1AcLEA 蛋白在不同濃度 TFE 的條件下 CD 光譜值 spectra of AcLEA at different concentrations of trifluoroethanol (TFE) （計(jì)算數(shù)據(jù)得出，隨 TFE 濃度增加至 66 %時(shí)，螺旋結(jié)構(gòu)增加比例相對減少（圖 1.2）。但進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，AcLEA 蛋白改變，只有在誘導(dǎo)劑 TFE 條件下才會形成以 α-螺旋為主的

在非生物脅迫條件下會產(chǎn)生各種應(yīng)激機(jī)制，以應(yīng)對不同程度的壓力挑戰(zhàn)（S這一過程中，產(chǎn)生了各類蛋白以應(yīng)對非生物脅迫，其中 LEA3 蛋白已成為近幾自 Amaranthuscruentus（籽粒莧）的 LEA3 蛋白家族的 AcLEA 基因轉(zhuǎn)化大腸桿迫（40℃處理 2 h）、鹽脅迫（0.4, 0.6 和 0.8 M NaCl）以及氧化脅迫（0.1, 0.理下研究該蛋白的作用，結(jié)果顯示，表達(dá) AcLEA 蛋白的菌株相比對照菌株有aucedo et al. 2017）。桿菌是原核生物的模式菌，而酵母是真核生物的模式菌，同樣地，為了研究在細(xì)胞中積累的 LEA 蛋白的功能，很多研究者使用釀酒酵母異源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行析，以此來研究 LEA3 蛋白的功能，同時(shí)將空載、來自大麥的 HVA1（LEA3） le4（LEA2）以及 le25（LEA1）轉(zhuǎn)入釀酒酵母，構(gòu)建重組菌株，在高鹽（A.1MKCl）和高滲（C.2M 山梨糖醇）處理?xiàng)l件下，表達(dá) HVA1 基因的重組菌株相后期縮短，由對照菌株的 40h 縮短為 20h，值得注意的是，表達(dá) HVA1 基因的比表達(dá) le25 的菌株短，表明 HVA1 蛋白的產(chǎn)生在高濃度 NaCl 脅迫下比 LE25母細(xì)胞，且隨時(shí)間延長，其生長率更高（Zhang et al. 2000）。

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本文編號：2786247