【摘要】：萜類化合物是廣泛存在于植物中的一大類天然產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,功能多樣,不僅在植物與環(huán)境的互作中發(fā)揮著重要功能,許多還被應(yīng)用于藥物、香水、調(diào)料和工業(yè)原料等領(lǐng)域。近年來,隨著合成生物學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,萜類化合物的合成途徑研究日趨完善,相關(guān)酶的挖掘與鑒定也成為研究熱點(diǎn)。萜類化合物的共同前體異戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)及其異構(gòu)體二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)在異戊烯轉(zhuǎn)移酶的作用下生成不同的萜類前體,進(jìn)一步由萜烯合酶催化形成不同的萜類骨架,如單萜(C_(10))、倍半萜(C_(15))、二萜(C_(20))、二倍半萜(C_(25))和三萜(C_(30))等。傳統(tǒng)的萜類化合物分離方法是直接從植物中進(jìn)行分離提取,然而許多萜類化合物在植物中含量很低或其合成受到植物的生長和環(huán)境影響很大,所以應(yīng)用傳統(tǒng)方法來發(fā)現(xiàn)新的萜類骨架化合物已經(jīng)越來越困難。在萜類化合物的生物合成途徑中,萜烯合酶通過催化前體的環(huán)化反應(yīng)從而形成結(jié)構(gòu)多樣的核心骨架,為萜類化合物結(jié)構(gòu)的多樣性奠定基礎(chǔ)。因此,對植物基因組編碼的萜烯合酶進(jìn)行功能表征,可以為系統(tǒng)挖掘植物中的萜類骨架化合物提供新方法和手段。通過合成生物學(xué)的技術(shù)對酵母底盤細(xì)胞的萜類合成前體途徑進(jìn)行強(qiáng)化,可以為萜烯合酶的系統(tǒng)挖掘和鑒定提供所需的底盤。再結(jié)合植物基因組注釋分析系統(tǒng)的整理并挖掘植物編碼的所有萜烯合酶,導(dǎo)入到萜類底盤細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)物分析與功能鑒定。這種“即插即用”的萜烯合酶功能鑒定方法,為發(fā)現(xiàn)新的萜類化合物骨架提供了新的機(jī)遇。本文通過搜集已功能鑒定的三萜合酶元件并進(jìn)行序列與功能的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)三萜合酶在進(jìn)化關(guān)系上相對保守,氨基酸序列的相似性較高,以糧食農(nóng)作物玉米為例,初步建立挖掘三萜合酶元件的方法,找到兩個三萜合酶候選基因,經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測產(chǎn)物不同于課題組已有的三萜化合物,需要做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。通過核磁和質(zhì)譜分析鑒定出zea3-2化合物的結(jié)構(gòu)為simiarenol。本文首次在玉米中鑒定到simiarenol且挖掘到三萜合酶,為將來利用合成生物學(xué)技術(shù)來大量合成simiarenol提供了必須的元件,并證實(shí)了此挖掘方法的優(yōu)勢,有助于挖掘新功能的三萜合酶。通過搜集已功能鑒定的倍半萜合酶元件,發(fā)現(xiàn)序列與功能間聯(lián)系不緊密,因此進(jìn)一步搜集單萜合酶、二萜合酶元件,與三萜合酶和倍半萜合酶元件一起構(gòu)建進(jìn)化樹,分析倍半萜合酶在萜烯合酶中的進(jìn)化關(guān)系。發(fā)現(xiàn)其在萜烯合酶進(jìn)化樹中與單萜合酶和二萜合酶之間能分簇,但簇間有交叉,說明可以通過功能簇分類初步界定倍半萜合酶,再從每個OTU中選擇代表序列進(jìn)行克隆表達(dá)鑒定。以三七為例,已克隆到分屬于5個功能簇的10個OTU的代表序列,將其中7個OTU的代表序列導(dǎo)入倍半萜酵母底盤細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá),但是Western blot分析表明這些序列在酵母底盤細(xì)胞中都沒有表達(dá)或者表達(dá)很弱,所以沒有檢測到新的產(chǎn)物生成。這說明后續(xù)工作仍需對酵母表達(dá)體系做進(jìn)一步的優(yōu)化。以上研究,通過系統(tǒng)整理和分析已知功能的萜烯合酶序列與功能的關(guān)系,探索了結(jié)合合成生物學(xué)技術(shù)來系統(tǒng)鑒定植物三萜和倍半萜骨架化合物的方法,有助于植物中三萜和倍半萜骨架化合物的系統(tǒng)挖掘。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943;Q811.4
【圖文】：

物的合成途徑及不同萜烯合酶（引自 Eran Pichersky.2011thetic pathways of terpenoids and different terpene synthases.(Pichersky.2011.The Plant Journal)研究進(jìn)展Ss）起源于古萜烯合酶，通過系統(tǒng)發(fā)育分析通常把30：TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g 是被子植物特有的分支，TPS-d 是裸子植物特子植物與裸子植物中，TPS-h 目前只在石松屬的江發(fā)現(xiàn)。其中 TPS-a 主要由倍半萜合酶組成，TPS-bPS-c、TPS-e/f 主要由二萜合成酶組成31。的不同，可將 TPSs 分為兩類，主要由三個結(jié)構(gòu)域組利用三核金屬簇（trinuclear metal culster）來誘導(dǎo)

三萜合酶和倍半萜合酶元件的挖掘與鑒定丙基陽離子和無機(jī)焦磷酸鹽，活性位點(diǎn)位于 折疊中間。cla子化異戊二烯底物末端碳-碳雙鍵，第三位產(chǎn)生一個碳離子1，面，如角鯊烯-霍烯合酶32。的預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí) class I 萜烯合酶有 , β 和 βγ 三杉中鑒定到的二萜合酶 紫杉二烯合酶，它的晶體結(jié)構(gòu)首 βγ 的形式存在， 域有催化活性，βγ 無活性33。然而 class中活性位點(diǎn)位于 βγ 界面， 域無活性34，因此 class II 萜烯合酶的那樣，萜烯合酶主要有如下幾種不同的構(gòu)型： , β, βγ 和 在于雙功能酶中。

三萜合酶和倍半萜合酶元件的挖掘與鑒定種陽離子中間體在五環(huán)三萜的生物合成中發(fā)揮作用5物元件主要來源于自然界，據(jù)報道有超過 80000 種月，uniprot 數(shù)據(jù)庫中收錄的功能鑒定的萜烯合酶僅有合酶但未進(jìn)行功能鑒定。說明我們目前發(fā)現(xiàn)的萜烯合和進(jìn)行功能表征，為不同功能萜類化合物的發(fā)現(xiàn)和

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本文編號：2786068