【摘要】：含腈水合酶的細(xì)胞能夠催化腈水合反應(yīng)生產(chǎn)酰胺,具有重要的工業(yè)用途。但游離細(xì)胞在催化過程中容易失活,破裂的細(xì)胞影響產(chǎn)品的分離純化。固定化細(xì)胞技術(shù)能有效的解決這些問題。但目前已報道的含腈水合酶固定化細(xì)胞穩(wěn)定性普遍較低,或固定化過程中存在一定的毒性,對細(xì)胞傷害較大。為解決上述問題,本研究開展含腈水合酶重組大腸桿菌的固定化研究,選擇3-氰基吡啶水合生成煙酰胺作為模型反應(yīng),主要結(jié)果如下:(1)比較了海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、卡拉膠、瓊脂和DA-F127水凝膠等固定化方法,考察固定化過程的酶活回收率和固定化細(xì)胞的批次反應(yīng)情況。篩選得到兩種效果較好的固定化方法,即海藻酸鈣固定化法和DA-F127水凝膠固定化法。其中海藻酸鈣固定化細(xì)胞的酶活回收率達(dá)到48.08%,DA-F127水凝膠固定化細(xì)胞的酶活回收率達(dá)到61.28%。兩種固定化細(xì)胞均可重復(fù)使用3個批次以上,酶活損失較小。(2)對海藻酸鈣法進(jìn)行固定化條件優(yōu)化。確定固定化的最佳條件為:海藻酸鈉濃度為3%,氯化鈣濃度為3%,細(xì)胞添加量為17.5mg/g載體,優(yōu)化后海藻酸鈣固定化細(xì)胞的酶活回收率達(dá)到56.73%。確定了固定化細(xì)胞最適反應(yīng)pH為7.0,最適反應(yīng)溫度為18℃。研究了固定化細(xì)胞催化生產(chǎn)煙酰胺的反應(yīng)工藝,確定了最優(yōu)條件,最優(yōu)條件下的海藻酸鈣固定化細(xì)胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成6個批次的轉(zhuǎn)化,與游離細(xì)胞催化過程相比,單位質(zhì)量菌體的煙酰胺產(chǎn)量提高了 4.91倍。(3)對DA-F127水凝膠法進(jìn)行固定化條件優(yōu)化,確定固定化的最佳條件為:DA-F127濃度為15%,UV光照射距離為20 cm、光照時間6 min,菌體包埋量為20 mg/g載體,優(yōu)化后的固定化細(xì)胞酶活回收率為89.74%。確定了固定化細(xì)胞最適反應(yīng)pH為7.0,最適反應(yīng)溫度為18℃對DA-F127固定化細(xì)胞催化生產(chǎn)煙酰胺進(jìn)行初步研究,最優(yōu)條件下的DA-F127固定化細(xì)胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成至少9個批次的轉(zhuǎn)化。與游離細(xì)胞催化過程相比,單位質(zhì)量菌體的煙酰胺產(chǎn)量提高了 12倍。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q814.2
【圖文】：

Ｏｕｔｅｒ－ｓｐｈｅｒｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ；（ｃ）邋Ｓｅｃｏｎｄ邋ｏｕｔｅｒｓｐｈｅｒｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ逡逑腈水合酶催化機(jī)理較為復(fù)雜，目前受到人們普遍認(rèn)可的是Ｎｅｌｓｏｎ等提出的逡逑三種催化機(jī)理，如圖１．４所示。（ａ）內(nèi)球機(jī)制：腈水合酶活性中心的金屬離子與逡逑底物的腈基形成配體，接著水分子與ＣＴ發(fā)生親電加成，生成不穩(wěn)定中間體，隨逡逑后中間體發(fā)生分子重排生成酰胺。（ｂ）外球機(jī)制：酶活中心羥基中的氧原子與底逡逑物腈基的碳原子發(fā)生親核加成生成中間體，中間體經(jīng)過分子重排生成酰胺。（ｃ）逡逑第二外球機(jī)制：腈水合酶的一個殘基處于氧化狀態(tài)，與水分子結(jié)合，水分子被活逡逑性中心激活

第一章文獻(xiàn)綜述逡逑ＤＡ－Ｆ１２７是Ｆ１２７水溶液經(jīng)由丙烯酰氯酯化接枝生成。再經(jīng)紫外光照射即可逡逑在短時間內(nèi)形成水凝膠［７７］。凝膠形成過程如圖１．５所示。Ｆ１２７的ＰＥＯ嵌段頂端逡逑與丙烯酰氯酯化生成ＤＡ－Ｆ１２７，在水溶液中ＤＡ－Ｆ１２７形成膠束，親水外殼是含逡逑丙烯酰基的ＰＥＯ基團(tuán)，加入光引發(fā)劑后，在紫外光的照射下，碳碳雙鍵發(fā)生聚逡逑合反應(yīng)形成牢固的水凝膠［７８］。逡逑圖１．５邋ＤＡ－Ｆ１２７水凝膠成膠過程原理圖［７９１逡逑Ｆｉｇ邋１．５邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｇｅｌａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑為進(jìn)一步了解ＤＡ－Ｆ１２７水凝膠的成膠效果，Ｓｏｓｎｉｋ等將交聯(lián)后的凝肢凍干，逡逑通過電鏡觀察凍干ＤＡ－Ｆ１２７水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如圖１．６所示［８（）］。逡逑■逡逑圖１．６邋９ｗｔ％濃度ＤＡ－Ｆ１２７在ＵＶ光照下２０ｍｉｎ內(nèi)顯烎結(jié)構(gòu)＿逡逑Ｆｉｇ邋１．６邋Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋９ｗｔ％邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｗｉｔｈ邋ｉｎ邋２０邋ｍｉｎ邋ｕｎｄｅｒ邋ＵＶ邋ｌｉｇｈｔ逡逑ＤＡ－Ｆ１２７濃度影響水凝膠成膠孔徑和壁厚。Ｌｅｅ等制備了不同ＤＡ－Ｆ１２７濃逡逑度的水凝膠，凍干后，通過電鏡觀察水凝膠的交聯(lián)形態(tài)，得到凝膠的孔徑和壁厚逡逑與ＤＡ－Ｆ１２７濃度關(guān)系如表１．５所示。隨著ＤＡ－Ｆ１２７濃度的增加，ＤＡ－Ｆ１２７水凝逡逑膠的孔徑增加，壁厚也有所增加。他們據(jù)此推測，在高濃度ＤＡ－Ｆ１２７中，形成逡逑１２逡逑

的膠束在光交聯(lián)反應(yīng)前處于高擁擠狀態(tài)，交聯(lián)形成的水凝膠產(chǎn)生較大空隙。而在逡逑低濃度溶液中，反應(yīng)形成的水凝膠空隙較小，水凝膠壁厚更薄。不同濃度ＤＡ－Ｆ１２７逡逑水凝膠電鏡結(jié)構(gòu)圖如圖１．７所示。逡逑表１．５不同濃度ＤＡ－Ｆ１２７在２５邋°Ｃ經(jīng)紫外光照射５邋１１１丨１１成膠形態(tài)［８１］逡逑Ｔａｂｌｅ邋１．５邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ邋ｐｒｅｐａｒｅｄ邋２５邋°Ｃ邋ｂｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋５邋ｍｉｎ邋ＵＶ邋ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋（ｗｔ％）邐Ｐｏｒｅ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋（ｐｍ）邐Ｗａｌｌ邋ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ邋（｜ｉｍ）逡逑９邐５．５邋±邋１．６邐１．３邋±０．４逡逑１３邐１０．０邋±２．４邐２．２邋±邋１．０逡逑邐１７邐１１．８邋土邋２．５邐５．２邋±２．６邐逡逑Ｕｎｐａｃｋｅｄ邋ｍｉｃｅｌｌｅｓ邐＾逡逑ａｔ９ｗｔ％逡逑費(fèi)；

本文編號：2784377