發(fā)布時(shí)間：2020-08-06 20:13

【摘要】：在植物生長(zhǎng)和防御非生物脅迫(如高溫等)等分子機(jī)制中,熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock factors,HSF)、熱激蛋白(Heat shock proteins,HSP)、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)起著至關(guān)重要的作用。玉米(Zea mays)作為重要的糧食作物,易受到不良環(huán)境如高溫、水澇等影響,從而導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量下降。目前,關(guān)于玉米高溫脅迫下HSP、HSF、APX和CAT基因家族的研究較少,因此,對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)研究揭示它們?cè)谥参锟鼓孢^(guò)程中的生物學(xué)功能將為提高玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究利用最新測(cè)序的玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)玉米HSP、HSF、APX和CAT基因家族成員進(jìn)行全基因組鑒定與分析;通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析在高溫脅迫下玉米B73品系中基因表達(dá)情況;利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)研究玉米HSP、HSF、APX和CAT基因家族在高溫脅迫下的表達(dá)情況。為明確玉米HSP、HSF、APX和CAT的功能及在抗高溫過(guò)程中分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究主要獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.從玉米B73基因組中鑒定得到25個(gè)HSF、35個(gè)HSP(其中包括22個(gè)HSP70,2個(gè)HSP40,2個(gè)HSP90和9個(gè)s HSP)、8個(gè)APX和5個(gè)CAT基因,并鑒定其理化性質(zhì);通過(guò)對(duì)玉米、擬南芥和水稻三個(gè)物種中的HSP、HSF、APX和CAT基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,確定了其在進(jìn)化上的親緣關(guān)系;外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明,其各個(gè)基因家族成員所含內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目存在很大差異,內(nèi)含子的長(zhǎng)度也不盡相同,這些原因都可能造成基因功能的多樣性;通過(guò)對(duì)玉米HSF和HSP家族基因的蛋白質(zhì)基序分析表明,不同蛋白的結(jié)構(gòu)在保守基序上存在明顯的差異,為其功能的分化提供了依據(jù);通過(guò)對(duì)玉米HSF和HSP家族基因在不同組織中的表達(dá)譜分析表明,基因表達(dá)具有組織特異性。2.利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(高溫處理)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,結(jié)果分別從35209446和35205472個(gè)Clean data中共鑒定出1857個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs,1029個(gè)上調(diào),828個(gè)下調(diào)),DEGs的KEGG途徑富集分析表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑中的蛋白質(zhì)加工在玉米響應(yīng)高溫脅迫反應(yīng)中起著重要作用;此外,還鑒定出167個(gè)可能與玉米響應(yīng)高溫脅迫有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(TF,Transcription factor),它們屬于不同的TF家族(例如,HSF、MYB、AP2-EREBP、b-ZIP、b HLH、NAC和WRKY)。結(jié)果表明,玉米響應(yīng)高溫脅迫的過(guò)程中有許多基因發(fā)生了差異性表達(dá)。3.利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了玉米HSP、HSF、APX和CAT基因家族成員在高溫下的表達(dá)情況,結(jié)果表明,高溫脅迫處理可誘導(dǎo)這些基因家族中的大部分成員表達(dá)量上調(diào),但也存在部分基因下調(diào),說(shuō)明這些基因?qū)τ衩子酌珥憫?yīng)高溫脅迫的過(guò)程中所發(fā)揮的功能是可能不同。此外,這些基因在不同的組織器官中的表達(dá)量存在差異,說(shuō)明其調(diào)控作用可能存在組織特異性。
【學(xué)位授予單位】：安徽師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;Q945.78
【圖文】：

圖 1. 植物熱激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[54]Fig.1. Plant heat shock signal transduction pathway2．植物熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs）是維持生長(zhǎng)、適應(yīng)環(huán)境變化，植物形成的復(fù)雜有效防御體系中響應(yīng)逆境信號(hào)的中心元件[53-55]。HSF 首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)，隨后植物中首次報(bào)道出 HSF 是 1990 年關(guān)于熱脅迫下的番茄中[56]。隨著生物測(cè)序技術(shù)和生

binding domain，DBD)是一個(gè)包含反向平衡的β-折疊 (β1,β2,β3和 結(jié)構(gòu)(α1,α2和α3)的高度保守的區(qū)域，它專(zhuān)門(mén)定位和識(shí)別目標(biāo)啟動(dòng)元素 (Heat shock element, HSE) 并結(jié)合，隨后激活應(yīng)激響應(yīng)基因具有2個(gè)疏水7肽重復(fù)區(qū)域即疏水氨基酸殘基 (HR-A/B區(qū)域)的merization domain，OD）通過(guò)15 ~ 80 個(gè)堿性氨基酸與DBD連接位信號(hào)（Nuclear localization signal，NLS）是一段保守的堿性氨基域，可引導(dǎo)HSF進(jìn)入細(xì)胞核[67]；細(xì)胞核輸出信號(hào)（Nuclear export位于HSF的C 端，富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域，其可幫助HSF從細(xì)胞核輸69]。AHA基元是激活結(jié)構(gòu)，其含有大量疏水性氨基酸殘基（L、I、氨基酸殘基（W、F、Y）和酸性氨基殘基酸（E、D）[70]。轉(zhuǎn)錄抑essor domain，RD）是一段-LFGV-氨基酸序列，具有轉(zhuǎn)錄阻遏功能

圖 3A. 玉米種子 圖 3B. 玉米幼苗Fig 3A. Corn seed Fig 3B. Corn seedlings2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序方法簡(jiǎn)述2.2.1 總 RNA 分離，mRNA 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序使用 Trizol 試劑（Invitrogen，CA，USA）制備葉中的總 RNA。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè) 260/280nm 吸光度比值確定總 RNA 量和純度。在 Illumina 測(cè)序文庫(kù)制備之前，將來(lái)自三個(gè)生物重復(fù)的總 RNA 混合用于所有六個(gè) RNA 文庫(kù)。用聚-T-寡聚體附著的磁珠（Invitrogen，USA）分離大約 10μg 的總 RNA。純化后，在高溫下使用二價(jià)陽(yáng)離子將 mRNA 片段化成小片，然后將裂解的 RNA 片段逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生 mRNA-seq 樣品制備試劑盒（Illumina，San Diego，USA）的最終 cDNA 文庫(kù)，根據(jù)操作手冊(cè)。配對(duì)末端文庫(kù)的平均插入大小為 300bp（±20bp），然后在 IlluminaHiseq 2500 平臺(tái)上進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2782905