【摘要】：在自然界中,細(xì)菌采用多種適應(yīng)性策略或手段來(lái)應(yīng)對(duì)不斷變化的環(huán)境。值得注意的是,大多數(shù)細(xì)菌在響應(yīng)環(huán)境變化的過(guò)程中出現(xiàn)兩種不同的生長(zhǎng)方式:浮游模式和生物膜模式。生物膜的形成由多種因素控制,這些因素是細(xì)菌從浮游狀態(tài)到生物膜狀態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中的重要參與者,目前已發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控因子和分子開(kāi)關(guān)具有調(diào)控菌體從浮游狀態(tài)至生物膜狀態(tài)轉(zhuǎn)換的功能。這些調(diào)控因子和分子開(kāi)關(guān)聯(lián)合復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以響應(yīng)各種環(huán)境信號(hào)從而控制細(xì)菌自身生活方式的轉(zhuǎn)換,進(jìn)一步影響植物或者宿主的生長(zhǎng),但對(duì)其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制的了解極為有限。環(huán)境滲透壓對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)和存活至關(guān)重要,盡管目前已經(jīng)從不同細(xì)菌中鑒定到多個(gè)響應(yīng)環(huán)境滲透壓調(diào)節(jié)的調(diào)控因子,但滲透壓變化如何影響細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成和對(duì)宿主的定殖所知甚少。本研究中我們?cè)隈橊劥谭壕邪l(fā)現(xiàn)了一個(gè)OmpR-LrhA滲透壓響應(yīng)信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng),可反向調(diào)控駱駝刺泛菌的生物膜和運(yùn)動(dòng)性,并影響細(xì)菌對(duì)宿主植物的定殖,從而為該領(lǐng)域的研究帶來(lái)了新的認(rèn)識(shí)。LrhA是LysR家族的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白,其同源蛋白在不同細(xì)菌中被命名為HexA、PecT和RovM等,在不同細(xì)菌(變形桿菌、大腸桿菌、耶爾森氏菌等)中發(fā)揮多樣化的功能,如在細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成、致病性、耐藥性等方面發(fā)揮重要作用。本文以具有抗旱促生功能的植物內(nèi)生細(xì)菌駱駝刺泛菌(Pantoea alhagi LTYR-11Z)為研究對(duì)象,利用分子生物學(xué)手段,研究LrhA的生理生化功能,揭示其在調(diào)控細(xì)菌生物膜形成、運(yùn)動(dòng)性、植物定殖等方面扮演的角色,取得以下研究成果:(1)在P.alhagi LTYR-11Z中,LrhA可以正向調(diào)節(jié)生物膜的形成,負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)菌泳動(dòng)的能力;通過(guò)小麥吸附和定殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到:在不同時(shí)間點(diǎn),lrhA基因的缺失明顯降低了細(xì)菌對(duì)小麥的吸附和定殖能力,通過(guò)共聚焦顯微鏡更直觀的觀察到野生型和lrhA突變體之間這種能力的差異。說(shuō)明該基因可能作為一種重要的植物定殖調(diào)節(jié)因子,影響細(xì)菌對(duì)植物的吸附和定殖。(2)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),LrhA對(duì)eps起正向調(diào)節(jié)的作用,對(duì)flhDC起反向調(diào)節(jié)的作用。進(jìn)一步通過(guò)剛果紅定性以及胞外多糖(EPS)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LrhA可以增加EPS的合成量并影響生物膜形成,使用lacZ報(bào)告基因檢測(cè)野生型菌株和lrhA突變體中的eps的表達(dá)差異,進(jìn)一步明確了LrhA對(duì)eps在轉(zhuǎn)錄水平的正向調(diào)控,凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證了LrhA可以直接與eps啟動(dòng)子上游的一段序列特異結(jié)合,正向調(diào)控EPS的表達(dá),進(jìn)而影響生物膜的形成。同樣,我們發(fā)現(xiàn)lrhA可以逆向調(diào)節(jié)flhDC啟動(dòng)子的活性,在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)向調(diào)節(jié)flhDC的表達(dá)。EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LrhA和flhDC啟動(dòng)子之間存在特異性的結(jié)合,細(xì)菌泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了LrhA通過(guò)對(duì)flhDC的負(fù)向調(diào)節(jié)來(lái)影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。(3)構(gòu)建了opgGH啟動(dòng)子與lacZ報(bào)告基因的融合報(bào)告菌株,并檢測(cè)opgGH啟動(dòng)子的活性,發(fā)現(xiàn)LrhA正向調(diào)節(jié)opgGH啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,而且發(fā)現(xiàn)LrhA和opgGH啟動(dòng)子之間存在特異結(jié)合,并發(fā)現(xiàn)opgGH在正向調(diào)控生物膜和負(fù)向調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性方面起到重要的作用。此外,我們發(fā)現(xiàn)敲除lrhA的菌株與野生型菌株(WT)相比,OPGs的含量明顯降低,從而表明LrhA可正向調(diào)節(jié)opgGH啟動(dòng)子的表達(dá),進(jìn)而影響菌株中OPGs的含量。(4)利用蛋白印跡法發(fā)現(xiàn),分別敲除基因opgH和lrhA后,磷酸化的RcsB蛋白水平均明顯降低,但在缺失lrhA的菌株中回補(bǔ)opgGH后,該菌株的磷酸化RcsB蛋白表達(dá)量又可以恢復(fù)至較高的水平,從而證實(shí)OPGs濃度的增高可以激活細(xì)菌內(nèi)部的Rcs磷酸化通路。此外發(fā)現(xiàn)OPGs/OpgGH在P.alhagi中通過(guò)調(diào)控RcsB的磷酸化水平來(lái)調(diào)節(jié)eps和flhDC的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)生物膜的形成和細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性,而lrhA的表達(dá)同時(shí)又被激活的Rcs磷酸化系統(tǒng)反饋抑制。(5)通過(guò)Real-time PCR發(fā)現(xiàn):隨著NaCl和山梨醇濃度的提高,lrhA、opgG和opgH的mRNA水平呈不同程度的增多趨勢(shì),eps和opgGH的啟動(dòng)子活性大幅度提高,flhDC啟動(dòng)子活性降低。但缺失基因lrhA后,菌株不再響應(yīng)外界滲透壓的變化。以上結(jié)果提示,lrhA在調(diào)節(jié)eps、flhDC和opgGH的過(guò)程中,要受到環(huán)境滲透壓的調(diào)節(jié)。同樣,隨著NaCl和山梨醇濃度的提高,野生型菌株的生物膜生成量增多,細(xì)菌的泳動(dòng)能力降低,植物定殖能力增強(qiáng);但是,在缺失lrhA以后,無(wú)論滲透壓如何變化,生物膜的形成、泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)、根部定殖等無(wú)明顯改變。(6)利用生物信息學(xué)分析了lrhA啟動(dòng)子區(qū)域與OmpR可能的結(jié)合位點(diǎn),使用lacZ報(bào)告基因檢測(cè)野生型菌株和ΔompR中的lrhA的表達(dá)差異,進(jìn)一步明確OmpR對(duì)lrhA的正向調(diào)控,EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OmpR可以直接與lrhA啟動(dòng)子上游的一段序列特異結(jié)合。此外,驗(yàn)證了OmpR通過(guò)響應(yīng)環(huán)境滲透壓的變化調(diào)控lrhA的表達(dá)。基于這些結(jié)果,本文提出了相應(yīng)的動(dòng)態(tài)模型:OmpR-LrhA響應(yīng)周?chē)h(huán)境中的滲透壓變化,通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)eps,flhDC和opgGH啟動(dòng)子的表達(dá),進(jìn)而控制細(xì)菌浮游/生物膜方式的轉(zhuǎn)變。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q93
【圖文】：

圖 1-1 生物膜的形成階段(Sauer 2003a)Figure1-1 Stges of biofilm formation1.2.6 生物膜形成的調(diào)控機(jī)制生物膜的形成由很多種因素控制，這些因素是細(xì)菌從浮游狀態(tài)到生物膜狀態(tài)轉(zhuǎn)過(guò)程中的重要參與者，這其中就包括很多細(xì)胞內(nèi)分子，主要為一些信使分子如 c-

本文技術(shù)路線

圖 2-1 lrhA 基因的缺失突變對(duì)生物膜生成量的影. alhagi biofilm formation by LrhA. The ΔlrhA mutd on abiotic surface compared with the WT strain, (pKT100-lrhA) restored the biofilm formation capa values±SD of three independent biological replica

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本文編號(hào)：2782763