【摘要】：氮素是植物生長發(fā)育必需的大量元素,植物根系從土壤獲得的氮素營養(yǎng)以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮為主要形式。在自然條件下,大豆主要依賴于與根瘤菌的共生作用,直接將自然界中氮固定位植物可利用的氮源。但根瘤菌是一種革蘭氏陰性菌,也能夠引起宿主的免疫反應(yīng),并隨著根瘤菌侵染及共生關(guān)系的建立,免疫反應(yīng)水平逐漸降低。因此,抑制大豆的免疫反應(yīng)是建立大豆與根瘤菌共生固氮的必要條件之一,但是在此過程中免疫反應(yīng)動態(tài)調(diào)控的機(jī)制還不清楚。前期他人的染色質(zhì)免疫共沉淀測序研究發(fā)現(xiàn),百脈根中結(jié)瘤重要轉(zhuǎn)錄因子LjNIN(Nodule Inception)在擬南芥AtBAK1的同源基因LjBAK1的啟動子上有富集,說明很可能LjNIN轉(zhuǎn)錄調(diào)控植物免疫反應(yīng)。為了探索這種機(jī)制是否存在,我們以大豆為研究對象,分析了大豆GmBAK1s家族基因,并對其中候選基因在共生固氮中的生物學(xué)功能及其與GmNINa的關(guān)系進(jìn)行了研究,并取得以下進(jìn)展:對大豆AtBAK1的同源基因開展了較為系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。通過對GmBAK1s家族基因進(jìn)行鑒定及系統(tǒng)發(fā)生分析,在大豆基因組中共鑒定出5個AtBAK1的同源基因,根據(jù)其在染色體上的位置命名為GmBAK1a、GmBAK1b、GmBAK1c、GmBAK1d和GmBAK1e。進(jìn)一步通過eFP網(wǎng)站中的表達(dá)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),GmBAK1d和GmBAK1e在地下部根部和根瘤特異表達(dá)。最后,通過啟動子元件分析,發(fā)現(xiàn)GmBAK1e啟動子失去了防御反應(yīng)相關(guān)順式作用元件,但出現(xiàn)了4個NBS(NIN binding site)結(jié)合元件,預(yù)示可能該基因受NIN轉(zhuǎn)錄調(diào)控。對GmBAK1e的生物學(xué)功能初步研究發(fā)現(xiàn),通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)造成GmBAK1e功能缺失可以提高大豆結(jié)瘤數(shù)目,而過表達(dá)GmBAK1e則導(dǎo)致大豆結(jié)瘤受到抑制,結(jié)瘤數(shù)目減少,說明GmBAK1e是大豆結(jié)瘤中的負(fù)調(diào)控因子。進(jìn)一步通過RT-qPCR和GUS染色分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論在大豆還是在煙草中,過表達(dá)GmNINa均可以抑制GmBAK1e的表達(dá)。最后,通過EMSA技術(shù)初步證明GmNINa可以直接結(jié)合GmBAK1e啟動子上的NIN結(jié)合元件。該結(jié)果預(yù)示著GmNINa可能直接靶向并抑制調(diào)控GmBAK1e轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果表明GmBAK1e是調(diào)控大豆共生結(jié)瘤的一個負(fù)調(diào)控因子,其表達(dá)很可能受GmNINa直接調(diào)控�；贏tBAK1在植物免疫中的重要作用,本結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步深入研究GmBAK1e的功能及其與GmNINa在根瘤菌侵染及共生固氮中關(guān)系和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S565.1;Q943.2
【圖文】：

圖 1. 結(jié)瘤過程中根系協(xié)調(diào)發(fā)育(Oldroyd et al 2008)。Figure 1. Coordinated root development during nodulation.1.1.4 結(jié)瘤信號轉(zhuǎn)錄因子 NIN 研究進(jìn)展Griesmann 等在生物固氮起源和多樣性新機(jī)制項目研究中，發(fā)現(xiàn)根瘤菌和豆科植物的共生固氮是適應(yīng)土壤低氮條件的產(chǎn)物，是一種獨特的生物學(xué)適應(yīng)機(jī)制。NIN 和 RHIZOBIUM-DIRECTED POLAR GROWTH (RPGRH)是固氮遺傳代謝通路上的關(guān)鍵的不可或缺的兩個基因，它們的丟失與固氮分支中非固氮植物丟失固氮性狀正好相一致（Griesmann et al 2018）。NIN 是結(jié)瘤早期關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，是首個在結(jié)瘤中被發(fā)現(xiàn)的結(jié)瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，NIN 基因突變造成了結(jié)瘤異常表型, 而 NIN 過表達(dá)的根中能產(chǎn)生類似于根瘤原基的結(jié)構(gòu)，即自發(fā)結(jié)瘤。ProNIN::GUS 結(jié)果顯示在根瘤菌侵染之后 NIN 在表皮只有

疫系統(tǒng)動態(tài)相互作用模式圖（Jones and Dangl 2006）。igzag model illustrates the quantitative output of the plant immune sy PTI 模式識別受體研究進(jìn)展別受體（PRRs）是一種受體類激酶 (RLKs)，它具有配體結(jié)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)激酶域，或受體類蛋白質(zhì)缺少一個重要的細(xì)胞內(nèi)成一個異受體復(fù)雜的 RLKs 或類似于受體的細(xì)胞質(zhì)激酶給下。鞭毛受體 FLS2 有豐富的亮氨酸重復(fù) (LRR)細(xì)胞外域和活′omez et al 2000）。FLS2 和它的共同受體油菜內(nèi)脂素激活受體細(xì)菌鞭毛，它們的激酶結(jié)構(gòu)域都通過轉(zhuǎn)磷酸酯化，允許由葡1)，增殖蛋白激酶 MAPK 和鈣依賴蛋白激酶 CDPK 調(diào)節(jié)下游2010; Zhang et al 2010）。延伸因子受體 EFR，也需要 BAK1

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文菜內(nèi)脂素受體 BRI1 互作蛋白，即 BAK1，被認(rèn)為是油菜內(nèi)脂素途徑上同時也被命名為 SERK3，屬于 SERK 家族（共 5 個成員）。在植物免K1/SERK3 與其他幾個 PRRs 形成異二聚體，包括 EFR 和感知內(nèi)源性s）的受體 (PEPR1) (圖 3）。BAK1 家族類受體激酶分別接觸 BRI1 與 FLS2 與鞭毛蛋白結(jié)合處參與配體傳感，發(fā)揮共受體作用（Santiaun et al 2013）。SERK3/BAK1 和 SERK4（也稱為 BAK1 like 1, BKK素獨立負(fù)調(diào)控細(xì)胞死亡，擬南芥 bak1serk4 突變體表現(xiàn)出幼苗致死和自He et al 2007; Kemmerling et al 2007）。蛋白 N 端糖基化和核胞漿轉(zhuǎn)運(yùn) 和 SERK4 調(diào)控的細(xì)胞死亡控制（de Oliveira et al 2016; Du et al 2016），BAK1 或其外域的過度表達(dá)也可能通過本構(gòu)性防御激活觸發(fā)細(xì)inguez-Ferreras et al 2015）。因此，BAK1 的穩(wěn)態(tài)對其在植物生長和免有重要意義。

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本文編號：2777040