【摘要】：作為細(xì)胞的“能量工廠”,線粒體是高毒性環(huán)境污染物苯硫酚優(yōu)先進(jìn)攻的靶標(biāo),同時(shí)與痕量苯硫酚殘留引起的致病活性氧(ROS)的產(chǎn)生有關(guān)。為了實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)這些過(guò)程,本文開發(fā)一種能高靈敏檢測(cè)線粒體內(nèi)苯硫酚的熒光探針。檢測(cè)衰老細(xì)胞有助于闡明衰老相關(guān)過(guò)程以及診斷衰老相關(guān)疾病等。衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作為一種溶酶體水解酶,是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞衰老生物標(biāo)志物。但是,在生物體中檢測(cè)SA-β-gal時(shí),非衰老相關(guān)β-gal通常會(huì)產(chǎn)生一定的干擾�？紤]到SA-β-gal與其它非衰老相關(guān)β-gal所處的溶酶體pH有可能不同,本文開發(fā)一種能識(shí)別溶酶體pH的β-gal熒光探針。具體內(nèi)容如下:(1)本文開發(fā)了一種新型半羅丹明半熒光素(rhodol)染料ROAP,并以此為熒光團(tuán)、2,4-二硝基苯基為識(shí)別基團(tuán)、吡啶鹽為線粒體定位基團(tuán),構(gòu)建了線粒體靶向的苯硫酚熒光探針ROAL。該探針對(duì)苯硫酚有高的選擇性和靈敏度,且檢出限低至8.1 nM。共定位實(shí)驗(yàn)表明探針ROAL具有良好的定位線粒體的能力,其皮爾森相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.95,從而實(shí)現(xiàn)了特異性檢測(cè)線粒體內(nèi)苯硫酚。此外,本文還將探針ROAL應(yīng)用于苯硫酚刺激的固定細(xì)胞和活細(xì)胞中進(jìn)行成像研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定細(xì)胞顯示出強(qiáng)熒光,而活細(xì)胞顯示出弱熒光,說(shuō)明苯硫酚會(huì)誘導(dǎo)活細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生活性氧,并且產(chǎn)生的活性氧又能消除苯硫酚。(2)本文以pH敏感的半花菁染料CPH為骨架,β-半乳糖苷鍵為識(shí)別位點(diǎn),構(gòu)建了一種可識(shí)別溶酶體pH的β-gal熒光探針CA。由于溶酶體的pH范圍為4.0-6.0,米曲霉β-半乳糖苷酶(A.oryzaeβ-gal)的活性最適pH為4.0-5.0,大腸桿菌β-半乳糖苷酶(E.coilβ-gal)的活性最適pH為7.4,所以在體外實(shí)驗(yàn)中,本文選擇A.oryzaeβ-gal和E.coilβ-gal共同驗(yàn)證探針CA的pH敏感性。探針CA與A.oryzaeβ-gal反應(yīng)顯示出綠色熒光,與E.coilβ-gal反應(yīng)顯示出紅色熒光,結(jié)果表明CA在不同pH下均能檢測(cè)β-gal,并且呈現(xiàn)出不同的熒光信號(hào),證明探針CA的確可同時(shí)檢測(cè)溶酶體pH和β-gal。本文還將探針CA應(yīng)用在卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和不同衰老程度的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中成像β-gal,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針CA不僅能區(qū)分成像SA-β-gal和SKOV-3β-gal,而且也成功監(jiān)測(cè)了細(xì)胞的衰老過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O657.3;Q-334
【圖文】：

西北大學(xué)碩士學(xué)位論文照射，熒光團(tuán)最高占據(jù)軌道 (HOMO) 上的電子被激發(fā)到最低空軌道 (LUMO) 上，識(shí)別基團(tuán)的 LUMO 軌道處在熒光團(tuán) HOMO 和 LUMO 軌道之間，導(dǎo)致熒光團(tuán) LUMO軌道上的電子直接躍遷到識(shí)別基團(tuán)的 LUMO 軌道上而沒(méi)有辦法返回到熒光團(tuán)的HOMO 軌道上，進(jìn)而發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象。當(dāng)識(shí)別基團(tuán)與待測(cè)物結(jié)合或反應(yīng)后，識(shí)別基團(tuán)的 LUMO 軌道升高，使熒光團(tuán) LUMO 軌道上的電子能順利返回到基態(tài)，探針?lè)肿拥臒晒饣謴?fù)。a-PET 機(jī)理則是把熒光團(tuán)看作電子受體，識(shí)別基團(tuán)看作電子給體。識(shí)別基團(tuán)的HOMO 軌道位于熒光團(tuán) HOMO 軌道和 LUMO 軌道之間，識(shí)別基團(tuán) HOMO 軌道上電子會(huì)填充到熒光團(tuán)的基態(tài)，使熒光團(tuán) HOMO 軌道上受光激發(fā)到 LUMO 軌道上的電子無(wú)法再回到基態(tài)，從而沒(méi)有熒光出現(xiàn)。同樣地，識(shí)別基團(tuán)與分析物作用后，識(shí)別基團(tuán)的 HOMO 軌道降低，促使熒光團(tuán) LUMO 軌道上的電子能正�；氐交鶓B(tài)，發(fā)射出熒光。

圖 1.4 ICT 機(jī)理的示意圖Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism..5.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 機(jī)理[20, 24-27]設(shè)計(jì)的探針通常是由兩個(gè)不一樣光團(tuán)構(gòu)成，其中一個(gè)是能量給體 (Donor)，另一個(gè)是能量受體 (Acceptor)。當(dāng)受激發(fā)時(shí)，能量供體由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)射出熒光，緊接著處于基態(tài)的能量受過(guò)偶極 偶極相互作用接受到能量給體產(chǎn)生的熒光，提供了能量受體從基態(tài)躍遷發(fā)態(tài)的能量，從而產(chǎn)生熒光發(fā)射 (圖 1.5)。具有 FRET 效應(yīng)的熒光探針需要符合條件[26,27]：一、能量受體的吸收光譜和能量給體的發(fā)射光譜有一定的重疊；二、給體和受體間的距離必須小于 100 。

圖 1.4 ICT 機(jī)理的示意圖Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism.量轉(zhuǎn)移振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 機(jī)理[20, 24-27]設(shè)計(jì)的探針通常是中一個(gè)是能量給體 (Donor)，另一個(gè)是能量受體 (A供體由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)射出熒光，緊接著處于互作用接受到能量給體產(chǎn)生的熒光，提供了能量受從而產(chǎn)生熒光發(fā)射 (圖 1.5)。具有 FRET 效應(yīng)的熒光、能量受體的吸收光譜和能量給體的發(fā)射光譜有一的距離必須小于 100 。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉芳寧;梁琪;張炎;張衛(wèi)兵;;微生物β-半乳糖苷酶的研究進(jìn)展[J];中國(guó)釀造;2012年12期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 潘勝男;Rhodol類生物活性小分子熒光探針的構(gòu)建以及應(yīng)用研究[D];西北大學(xué);2017年

2 張親富;α-Fe_2O_3光催化降解有機(jī)物的光譜分析與研究[D];華中科技大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2776605