【摘要】：作為細胞的“能量工廠”,線粒體是高毒性環(huán)境污染物苯硫酚優(yōu)先進攻的靶標,同時與痕量苯硫酚殘留引起的致病活性氧(ROS)的產(chǎn)生有關(guān)。為了實時、準確的監(jiān)測這些過程,本文開發(fā)一種能高靈敏檢測線粒體內(nèi)苯硫酚的熒光探針。檢測衰老細胞有助于闡明衰老相關(guān)過程以及診斷衰老相關(guān)疾病等。衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作為一種溶酶體水解酶,是目前應用最廣泛的細胞衰老生物標志物。但是,在生物體中檢測SA-β-gal時,非衰老相關(guān)β-gal通常會產(chǎn)生一定的干擾�？紤]到SA-β-gal與其它非衰老相關(guān)β-gal所處的溶酶體pH有可能不同,本文開發(fā)一種能識別溶酶體pH的β-gal熒光探針。具體內(nèi)容如下:(1)本文開發(fā)了一種新型半羅丹明半熒光素(rhodol)染料ROAP,并以此為熒光團、2,4-二硝基苯基為識別基團、吡啶鹽為線粒體定位基團,構(gòu)建了線粒體靶向的苯硫酚熒光探針ROAL。該探針對苯硫酚有高的選擇性和靈敏度,且檢出限低至8.1 nM。共定位實驗表明探針ROAL具有良好的定位線粒體的能力,其皮爾森相關(guān)系數(shù)高達0.95,從而實現(xiàn)了特異性檢測線粒體內(nèi)苯硫酚。此外,本文還將探針ROAL應用于苯硫酚刺激的固定細胞和活細胞中進行成像研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定細胞顯示出強熒光,而活細胞顯示出弱熒光,說明苯硫酚會誘導活細胞的線粒體產(chǎn)生活性氧,并且產(chǎn)生的活性氧又能消除苯硫酚。(2)本文以pH敏感的半花菁染料CPH為骨架,β-半乳糖苷鍵為識別位點,構(gòu)建了一種可識別溶酶體pH的β-gal熒光探針CA。由于溶酶體的pH范圍為4.0-6.0,米曲霉β-半乳糖苷酶(A.oryzaeβ-gal)的活性最適pH為4.0-5.0,大腸桿菌β-半乳糖苷酶(E.coilβ-gal)的活性最適pH為7.4,所以在體外實驗中,本文選擇A.oryzaeβ-gal和E.coilβ-gal共同驗證探針CA的pH敏感性。探針CA與A.oryzaeβ-gal反應顯示出綠色熒光,與E.coilβ-gal反應顯示出紅色熒光,結(jié)果表明CA在不同pH下均能檢測β-gal,并且呈現(xiàn)出不同的熒光信號,證明探針CA的確可同時檢測溶酶體pH和β-gal。本文還將探針CA應用在卵巢癌細胞SKOV-3和不同衰老程度的人胚肺成纖維細胞MRC-5中成像β-gal,實驗結(jié)果表明探針CA不僅能區(qū)分成像SA-β-gal和SKOV-3β-gal,而且也成功監(jiān)測了細胞的衰老過程。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;Q-334
【圖文】：

西北大學碩士學位論文照射，熒光團最高占據(jù)軌道 (HOMO) 上的電子被激發(fā)到最低空軌道 (LUMO) 上，識別基團的 LUMO 軌道處在熒光團 HOMO 和 LUMO 軌道之間，導致熒光團 LUMO軌道上的電子直接躍遷到識別基團的 LUMO 軌道上而沒有辦法返回到熒光團的HOMO 軌道上，進而發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象。當識別基團與待測物結(jié)合或反應后，識別基團的 LUMO 軌道升高，使熒光團 LUMO 軌道上的電子能順利返回到基態(tài)，探針分子的熒光恢復。a-PET 機理則是把熒光團看作電子受體，識別基團看作電子給體。識別基團的HOMO 軌道位于熒光團 HOMO 軌道和 LUMO 軌道之間，識別基團 HOMO 軌道上電子會填充到熒光團的基態(tài)，使熒光團 HOMO 軌道上受光激發(fā)到 LUMO 軌道上的電子無法再回到基態(tài)，從而沒有熒光出現(xiàn)。同樣地，識別基團與分析物作用后，識別基團的 HOMO 軌道降低，促使熒光團 LUMO 軌道上的電子能正�；氐交鶓B(tài)，發(fā)射出熒光。

圖 1.4 ICT 機理的示意圖Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism..5.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 機理[20, 24-27]設(shè)計的探針通常是由兩個不一樣光團構(gòu)成，其中一個是能量給體 (Donor)，另一個是能量受體 (Acceptor)。當受激發(fā)時，能量供體由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)射出熒光，緊接著處于基態(tài)的能量受過偶極 偶極相互作用接受到能量給體產(chǎn)生的熒光，提供了能量受體從基態(tài)躍遷發(fā)態(tài)的能量，從而產(chǎn)生熒光發(fā)射 (圖 1.5)。具有 FRET 效應的熒光探針需要符合條件[26,27]：一、能量受體的吸收光譜和能量給體的發(fā)射光譜有一定的重疊；二、給體和受體間的距離必須小于 100 。

圖 1.4 ICT 機理的示意圖Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism.量轉(zhuǎn)移振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 機理[20, 24-27]設(shè)計的探針通常是中一個是能量給體 (Donor)，另一個是能量受體 (A供體由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)射出熒光，緊接著處于互作用接受到能量給體產(chǎn)生的熒光，提供了能量受從而產(chǎn)生熒光發(fā)射 (圖 1.5)。具有 FRET 效應的熒光、能量受體的吸收光譜和能量給體的發(fā)射光譜有一的距離必須小于 100 。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉芳寧;梁琪;張炎;張衛(wèi)兵;;微生物β-半乳糖苷酶的研究進展[J];中國釀造;2012年12期

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 潘勝男;Rhodol類生物活性小分子熒光探針的構(gòu)建以及應用研究[D];西北大學;2017年

2 張親富;α-Fe_2O_3光催化降解有機物的光譜分析與研究[D];華中科技大學;2012年

本文編號：2776605