發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 11:29

【摘要】：隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,微生物作為底盤細(xì)胞用于各類大宗或精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)引起了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。目前,酵母底盤細(xì)胞多采用常規(guī)碳源葡萄糖和甘油,但如甲醇、乙醇、乙酸等非常規(guī)發(fā)酵碳源正在被越來(lái)越多地開(kāi)發(fā)和利用。其中,乙酸是一種來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、節(jié)能環(huán)保的碳源,可被直接催化為乙酰輔酶A而作為許多大宗和精細(xì)化學(xué)品的合成前體,因而受到廣泛關(guān)注。畢赤酵母近年來(lái)被證實(shí)可以作為優(yōu)良的底盤宿主用于小分子醫(yī)藥、化工產(chǎn)品的生物合成。本課題即嘗試代謝工程改造畢赤酵母的乙酸耐受、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過(guò)程以促進(jìn)乙酸生物利用,進(jìn)一步探討乙酸作為碳源和生物合成前體的可行性。首先,乙酸的解離常數(shù)(pKa)為4.76,在低pH條件下對(duì)具有強(qiáng)烈的抑菌作用,涉及到一系列激酶相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,是酵母中乙酸利用必須面對(duì)的難題。本研究利用課題組已構(gòu)建的畢赤酵母激酶缺失文庫(kù)篩選乙酸耐受相關(guān)激酶,進(jìn)而通過(guò)激酶的缺失或過(guò)表達(dá),提高細(xì)胞對(duì)乙酸的耐受能力。其中,畢赤酵母PAS_chr3_1091基因(命名為hrk1)缺失株對(duì)乙酸呈現(xiàn)強(qiáng)烈敏感表型,說(shuō)明該基因?qū)σ宜崮褪苡姓嬗绊�。因此我們�?gòu)建了hrk1過(guò)表達(dá)菌株,同時(shí)以6-甲基水楊酸(6-MSA),作為報(bào)告化合物來(lái)評(píng)估乙酸利用效果,該化合物為真菌聚酮化合物,利用乙酰輔酶A為合成前體。hrk1過(guò)表達(dá)菌株的6-MSA產(chǎn)率最高可達(dá)80 mg/g cell,約為對(duì)照菌株的1.55倍。結(jié)果表明,hrk1過(guò)表達(dá)有效促進(jìn)了6-甲基水楊酸的合成,能夠促進(jìn)乙酸的生物利用。其次,乙酸發(fā)生解離后存在兩種形式,即分子形式的乙酸和離子形式的乙酸根離子,而酵母細(xì)胞膜上攜帶分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)分子和離子形式乙酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。由于酵母比較適合在偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng),因此我們推測(cè)增強(qiáng)分子形式乙酸的轉(zhuǎn)運(yùn)是促進(jìn)乙酸利用的一個(gè)必要環(huán)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道,釀酒酵母水-甘油通道蛋白ScFps1可促進(jìn)乙酸分子轉(zhuǎn)運(yùn),因此我們?cè)诋叧嘟湍钢羞^(guò)表達(dá)了釀酒酵母來(lái)源的ScFps1*并分析了胞外乙酸的消耗速率和6-甲基水楊酸的合成水平。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)ScFps1*未能有效促進(jìn)乙酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和6-甲基水楊酸的合成,說(shuō)明該條件下畢赤酵母自身的乙酸分子轉(zhuǎn)運(yùn)水平很可能已經(jīng)能滿足需求。再者,細(xì)胞內(nèi)乙酸的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致一系列的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程,因此加快胞內(nèi)乙酸的快速轉(zhuǎn)化也是加強(qiáng)乙酸代謝利用的關(guān)鍵步驟。乙酸可在微生物細(xì)胞內(nèi)經(jīng)乙酰輔酶A合成酶催化或乙酸激酶/磷酸轉(zhuǎn)乙�；腹餐呋D(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。本研究中通過(guò)過(guò)表達(dá)這些乙酸代謝相關(guān)基因,以6-MSA作為報(bào)告化合物,分析了它們對(duì)乙酸代謝利用的作用效果。畢赤酵母來(lái)源的乙酰輔酶A合成酶PpAcs1和釀酒酵母來(lái)源的乙酰輔酶A合成酶ScAcs1*能夠促進(jìn)畢赤酵母中乙酸的利用,它們的6-MSA產(chǎn)率最高可達(dá)47.0 mg/g cell和43.7 mg/g cell,分別是對(duì)照株的1.39倍和1.30倍。而大腸桿菌來(lái)源的乙酸激酶AckA和磷酸轉(zhuǎn)乙�；窹ta則沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。最后,將乙酸耐受和乙酸代謝兩部分中可以促進(jìn)乙酸代謝的基因進(jìn)行了組合表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)了乙酸生物利用。該研究通過(guò)改造畢赤酵母的乙酸耐受、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過(guò)程,有效地促進(jìn)了畢赤酵母底盤宿主的乙酸生物利用能力,為利用酵母宿主生物合成以乙酸和乙酰輔酶A為前體的醫(yī)藥、化工產(chǎn)品提供了參考。但由于畢赤酵母受乙酸嚴(yán)重殺傷的天然生理特性,要實(shí)現(xiàn)畢赤酵母利用乙酸為碳源進(jìn)行高效生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成依舊需要持續(xù)的深入研究。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78
【圖文】：

逡逑１．２．２真核生物的乙酸代謝逡逑在釀酒酵母中，乙酰輔酶Ａ合成酶（Ａｃｓ）催化乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶Ａ邋（圖１．３）。Ａｃｓ逡逑由兩個(gè)基因編碼，分別是ａｃｓ／和ａｃｓ２。ＶａｎｄｅｎＢｅｒｇ等…］比較了這兩個(gè)蛋白相應(yīng)的動(dòng)力逡逑學(xué)參數(shù)，Ａｃｓｌ對(duì)底物乙酸的值比Ａｃｓ２要低３０倍，基因ｗｓ／的表達(dá)受到高濃度葡逡逑萄糖和厭氧條件的限制，對(duì)非葡萄糖碳源條件的代謝十分關(guān)鍵。逡逑Ｃｈｅｎ等Ｍｌ發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的乙酰輔酶Ａ水平是原先的２．１９逡逑倍，ＡＴＰ提高了邋３．９２倍，細(xì)胞對(duì)乙醇的耐受能力明顯提升。Ｙｏｉｃｈｉｒｏ等在釀酒酵母中逡逑過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶（Ａｌｄ６）和乙酰輔酶Ａ合成酶（Ａｃｓｌ），提升了異戊二烯的產(chǎn)量。乙醛在逡逑

ｉ邋Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ邋丨逡逑Ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄｓ逡逑圖１．２釀酒酵母的乙酰輔酶Ａ代謝概覽Ｗ逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｏｖｅｒｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｉｎ邋ｉｎ邋Ｓ．邋ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．逡逑在以大腸桿菌和釀酒酵母為宿主菌的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，乙酰輔酶Ａ衍生品的產(chǎn)量逡逑也有較大的差別。大腸桿菌中乙酰輔酶Ａ直接在胞質(zhì)中被利用，而酵母中乙酰輔酶Ａ的逡逑代謝則被分割在不同的區(qū)室，包括線粒體、過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞核和胞質(zhì)。其中，乙酰逡逑輔酶Ａ主要在線粒體產(chǎn)生，但釀酒酵母自身缺少將乙酰輔酶Ａ直接從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞逡逑質(zhì)的機(jī)制１１１］。因此，當(dāng)乙酰輔酶Ａ衍生物合成時(shí)，乙酰輔酶Ａ不能得到充分利用。胞逡逑質(zhì)中的乙酰輔酶Ａ雖然由乙酸直接轉(zhuǎn)化而成，但乙酰輔酶Ａ合成酶Ａｃｓ對(duì)底物的親和逡逑性較低并且需要耗能［｜２］，成為一個(gè)限速步驟。因此，乙酸作為碳源和生物合成前體，可逡逑以在一定程度上解決細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶Ａ不足的問(wèn)題

比較特殊的是，谷氨酸棒狀桿菌畫ｇ７ｗ／

本文編號(hào)：2776411