【摘要】：磷脂雙分子層是自然界中最常見的自組裝結(jié)構(gòu)之一,它不僅為細胞和亞細胞區(qū)室提供保護性容器,還承載了許多用于細胞通訊和跨膜轉(zhuǎn)運的蛋白。人工制備的脂質(zhì)體和固體支持的磷脂雙分子層膜(SLB)作為最簡化的細胞和細胞膜模型,為研究細胞內(nèi)生化反應(yīng),跨膜轉(zhuǎn)運,以及膜表面化學(xué)提供了極好的平臺。DNA分子是自然界中另一種具有卓越自組裝能力的材料。近年來,DNA納米結(jié)構(gòu)與功能化修飾技術(shù)得到突飛猛進的發(fā)展,被廣泛應(yīng)用于生物傳感,藥物遞送,邏輯計算等領(lǐng)域。將磷脂雙分子層與DNA納米技術(shù)進行合理交叉結(jié)合,并借助當(dāng)前的單分子技術(shù),使得研究膜內(nèi)或膜表面酶促反應(yīng),藥物遞送等成為可能。本論文主要是以磷脂雙分子層為支撐平臺,結(jié)合DNA納米技術(shù),研究細胞環(huán)境下單分子酶的動力學(xué)機制以及細胞內(nèi)遞送。主要研究內(nèi)容如下:第一,針對在細胞環(huán)境中單分子酶動力學(xué)機制研究比較匱乏,本論文構(gòu)建了在模擬的細胞環(huán)境中對單分子酶可視化研究的平臺。通過將單個辣根過氧化物酶(HRP)包封在含有擁擠試劑的脂質(zhì)體中再連接到SLB界面,就可利用全內(nèi)反射顯微鏡實時監(jiān)測單分子酶促反應(yīng)過程中熒光強度的變化。分析結(jié)果表明在擁擠限域環(huán)境中酶分子活性狀態(tài)和抑制狀態(tài)的相關(guān)性減弱,產(chǎn)物對酶抑制程度降低。進一步,利用小角X射線散射實驗和模型重構(gòu),建立了擁擠環(huán)境中酶分子動力學(xué)參數(shù)變化與構(gòu)型變化的關(guān)系,對于理解生物學(xué)過程及研究細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等具有重要指導(dǎo)意義。第二,目前,在溶液環(huán)境中對快速擴散的蛋白動態(tài)過程難以在單分子水平上進行觀測,針對這一問題,本論文構(gòu)建了二維SLB膜上單分子酶級聯(lián)反應(yīng)的平臺,實現(xiàn)了對單個酶行為的可視化研究。將上游酶(過氧化氫酶)和下游酶(葡萄糖氧化酶)以不同方式錨定在SLB界面,就可以利用全內(nèi)反射顯微鏡實時追蹤二維界面上游酶和下游酶的運動行為。對單個酶運動軌跡的分析結(jié)果顯示,下游酶擴散系數(shù)的增加呈現(xiàn)底物依賴性,但是運動方向隨機。實驗和理論推導(dǎo)表明酶分子的‘趨向運動’是由平動與轉(zhuǎn)動競爭平衡的結(jié)果。本工作為研究蛋白質(zhì)的動態(tài)相互作用、抑制劑篩選等提供了新的思路。第三,將蛋白質(zhì)直接遞送到活細胞中在基礎(chǔ)研究和治療應(yīng)用中仍然具有挑戰(zhàn)。本論文將膽固醇功能化的DNA分別修飾到脂質(zhì)體和細胞膜表面,實現(xiàn)了DNA反平行雜交介導(dǎo)的脂質(zhì)體與細胞的膜融合以及蛋白的胞內(nèi)遞送。其中,HRP被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)并遞送到細胞胞漿,利用HRP催化反應(yīng)產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物可視化驗證了膜融合的發(fā)生,而且此過程不依賴于細胞內(nèi)吞。此外,利用鏈置換反應(yīng)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)研究了膜融合的時空可控性,并在多元體系中實現(xiàn)了DNA介導(dǎo)脂質(zhì)體與細胞的特異性融合。最后將細胞色素C遞送到胞漿中引發(fā)細胞凋亡。此膜融合策略在蛋白藥物遞送,基因編輯方面都具有良好的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q73

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