【摘要】：乳酸菌被廣泛應(yīng)用于乳制品、傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及益生菌產(chǎn)品中,其與腸道菌群的相互作用是國內(nèi)外研究的熱點。在高效選育過程中乳酸菌與病原微生物競爭成為優(yōu)勢菌是應(yīng)用的前提。本論文在構(gòu)建產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌識別方法的基礎(chǔ)上,以植物乳桿菌ZDY2013為研究對象,從多角度探究其拮抗食源性致病蠟樣芽孢桿菌的作用。全文分為六個章節(jié)。第一章緒論對食源致病菌的危害、蠟樣芽孢桿菌的毒性、乳酸菌的功能及乳酸菌與食源致病菌的相互作用機(jī)制進(jìn)行了分述,并對植物乳桿菌及其胞外多糖的功能進(jìn)行了概述。第二章建立了識別復(fù)雜食品基質(zhì)中產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌的特異性方法。針對蠟樣芽孢桿菌特異性序列設(shè)計了引物,并構(gòu)建了選擇性識別產(chǎn)嘔吐毒素和產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的復(fù)合擴(kuò)增體系;采用疊氮溴化丙錠(PMA)對樣品中細(xì)胞膜熱破損細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)處理,再提取基因組DNA用于后續(xù)分析;采用多種食品基質(zhì)、雜菌和死菌作為干擾因素考察復(fù)合擴(kuò)增方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,優(yōu)化后的復(fù)合擴(kuò)增體系能特異性識別產(chǎn)嘔吐毒素和產(chǎn)腸毒素的蠟樣芽孢桿菌,適用于淀粉類和乳制品等復(fù)雜食品基質(zhì)的分析;食品基質(zhì)中復(fù)雜菌群不影響該方法對目標(biāo)DNA的信號獲取,且無細(xì)胞活力的蠟樣芽孢桿菌的DNA信號能夠被有效消除;復(fù)雜食品基質(zhì)中的產(chǎn)嘔吐毒素菌株的最低檢測限是10~3 cfu/g,而低濃度的產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌(10~1 cfu/g)經(jīng)過短暫增菌也能被特異性識別。第三章探究了植物乳桿菌ZDY2013拮抗產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的作用方式。利用體外試驗確定產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌ATCC14579和HN001受抑制與植物乳桿菌培養(yǎng)液pH的相關(guān)性;利用植物乳桿菌與產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌在牛奶中共同培養(yǎng),探索酸奶發(fā)酵中優(yōu)勢菌如何形成;利用小腸上皮細(xì)胞模型,研究植物乳桿菌通過不同的粘附定植方式,阻止產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌粘附效果;利用細(xì)胞外乳酸脫氫酶活性指示產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌毒素對細(xì)胞的毒害,以及從細(xì)胞相關(guān)基因應(yīng)激過表達(dá)方面,研究植物乳桿菌對上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明,產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌在體外生長被抑制是植物乳桿菌產(chǎn)酸所致;在牛奶中共同發(fā)酵pH值不斷降低,蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量在24 h后也隨之下降,而植物乳桿菌不受pH降低的影響;植物乳桿菌能夠通過排斥、競爭和替換的方式在小腸上皮細(xì)胞上抑制產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌的粘附定植,且以競爭粘附位點為主;產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌的培養(yǎng)上清具有破壞上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)乳酸脫氫酶釋放的毒性,植物乳桿菌能保護(hù)上皮細(xì)胞,應(yīng)對產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)上清導(dǎo)致的相關(guān)基因應(yīng)激過表達(dá)。第四章探究了植物乳桿菌發(fā)酵奶干預(yù)產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌對小鼠造成的毒副作用。第一組小鼠先灌胃產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌再灌胃PBS緩沖液;第二組先灌胃植物乳桿菌發(fā)酵牛奶再灌胃產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌;第三組先灌胃產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌再灌胃植物乳桿菌發(fā)酵牛奶;第四組為對照組只灌胃PBS緩沖液。通過監(jiān)測小鼠體重指數(shù)變化,確定產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵牛奶對小鼠的直接影響;通過測定小鼠血清中炎癥因子的水平以及生理生化指標(biāo)變化,探究產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌對小鼠健康的干擾作用,以及灌胃植物乳桿菌發(fā)酵牛奶是否對其有改善作用;通過16S rDNA高通量測序,分析產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌是否擾亂腸道菌群平衡,以及植物乳桿菌發(fā)酵牛奶是否有利于其恢復(fù)。結(jié)果表明,產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌會導(dǎo)致小鼠體重增長放緩甚至降低,也會造成相關(guān)炎癥因子水平異常;植物乳桿菌發(fā)酵牛奶能阻止產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌導(dǎo)致全血中血小板數(shù)和血清中尿酸的升高,同時能夠減輕盲腸病理組織的損傷程度;產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌在不顯著性改變小鼠腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,能導(dǎo)致部分菌群的豐度發(fā)生改變,而植物乳桿菌發(fā)酵牛奶能夠緩和這種改變。第五章探究了植物乳桿菌胞外多糖拮抗產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌的特點。對胞外多糖進(jìn)行提取、純化,研究與其生物活性相關(guān)的分子量和單糖組分特征;采用磺化處理的方式對其進(jìn)行性能改良,并表征其功能基團(tuán);比較胞外多糖及其衍生物對多種自由基的清除能力,研究磺化處理對胞外多糖生物學(xué)活性的改變;利用小腸上皮細(xì)胞為模型,探索產(chǎn)不同腸毒素類型(一種、兩種或三種)蠟樣芽孢桿菌對細(xì)胞活性的破壞,以及胞外多糖或者其衍生物的存在對細(xì)胞活性的保護(hù)作用。結(jié)果表明,植物乳桿菌胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)429.4±30.0 mg/L、純度為96.06%;空間排阻色譜洗脫曲線證明胞外多糖只有一個峰,分子量為5.17×10~4 Da;氣相色譜圖表明胞外多糖只由木糖和半乳糖組成,且半乳糖占總含量的98.3%;胞外多糖經(jīng)過衍生化處理后,抗氧化活性明顯提高,隨之也增強(qiáng)抵抗產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)上清對小腸上皮細(xì)胞活性損傷的能力。第六章對植物乳桿菌拮抗食源性致病蠟樣芽孢桿菌的生物學(xué)功能及其初步機(jī)制進(jìn)行了總結(jié),并對未來研究工作進(jìn)行了展望。綜上所述,本文探究了益生植物乳桿菌與食源性致病蠟樣芽孢桿菌的相互作用,從體外、食品、細(xì)胞、小鼠以及代謝產(chǎn)物等層面解釋了植物乳桿菌拮抗產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌的現(xiàn)象,加深了乳酸菌與病原微生物互相作用研究的認(rèn)識,也為植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物在食品工業(yè)的開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3
【圖文】：

圖 1-1 嘔吐毒素的具體結(jié)構(gòu)[28]。Fig. 1-1 The structure of cereulide from Bacillus cereus芽孢桿菌能夠表達(dá)大量的腸毒素和酶類從而引起腹瀉疾病，不要因子[29]。非溶血性腸毒素（Nhe）、溶血性的腸毒素（Hbl白 K（CytK）被證實是蠟樣芽孢桿菌引起腹瀉型食物中毒的主 Hbl 由三種蛋白 B、L1和 L2組成，它們分別由 hblA、hblD 則包含三種蛋白 NheA、NheB 和 NheC，它們分別由 nheA、nhCytK 是 β 桶狀結(jié)構(gòu)的成孔毒素單一物質(zhì)[29]。Hbl 和 Nhe 的分測定方法有關(guān)，而 CytK 分子量為 34 kDa，具體見表 1-1。值分蠟樣芽孢桿菌能夠分泌腸毒素，然而，導(dǎo)致腹瀉疾病的蠟樣有上述幾種腸毒素，另外，這三種腸毒素的毒性強(qiáng)度也存在差表明 Nhe 是最強(qiáng)的致腹瀉毒素[33]。表 1-1 Hbl、Nhe 蛋白的分子量大小[29; 34]。Table 1-1 The molecular weight (Mw) of Hbl and Nhe proteins

7圖 1-2 一些芽孢桿菌（蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等）對細(xì)胞內(nèi)外酸環(huán)境的適應(yīng)性[46]。Fig. 1-2 The response of Bacilli (Bacillus cereus and B. subtilis) to the weak organic acid

圖 1-3 益生菌生物學(xué)特性[58]。Fig. 1-3 The physiological benefits of probiotics.1.2.2 乳酸菌在乳制品中的應(yīng)用益生菌與人類生活息息相關(guān)，從嬰幼兒所需的母乳、市場上受歡迎的酸奶、家庭中常見泡菜到益生菌保健品，益生菌在人類健康中發(fā)揮著不可替代的作用。目前，作為益生菌的乳酸菌在食品和保健品工業(yè)的全球市值超過 360 億美元，且年增速達(dá) 15-20%；據(jù)中商產(chǎn)業(yè)研究院預(yù)測，中國乳酸菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模在 2020 年將達(dá)到 850 億元。乳酸菌在牛奶發(fā)酵產(chǎn)品中發(fā)揮著菌種特有的生物特性[59]，包括產(chǎn)生的乳酸或者抗菌物質(zhì)提高奶制品的貨架期，一些病原微生物（單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌等）能利用牛奶中比較豐富的生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，積累一些抑菌的細(xì)菌素，目前一些乳酸菌的細(xì)菌素已被成功應(yīng)用于

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2764931