【摘要】：嗜熱酯酶是最具有應(yīng)用潛力的綠色生物催化劑之一,因其具有耐熱性、pH穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)。前期從超嗜熱菌Aquiex aeolicus VF5(風(fēng)產(chǎn)液菌)基因組中篩選得到一種嗜熱酯酶基因Aaeo1,實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌系統(tǒng)(Escherichia coli)中的異源表達(dá),發(fā)現(xiàn)其存在包涵體及催化活力低的問(wèn)題。為了得到高效的嗜熱酯酶,利用定向進(jìn)化對(duì)其進(jìn)行分子改造,通過(guò)兩步高通量篩選法得到可溶性表達(dá)和催化活力同時(shí)提高的突變株并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。具體包括:(1)建立了易錯(cuò)PCR(error-prone PCR,epPCR)突變反應(yīng)體系。確定最優(yōu)條件:Mg~(2+)7 mmol·L~(-1),Mn~(2+)0.2 mmol·L~(-1),平均突變率為0.31%,滿足構(gòu)建文庫(kù)要求;(2)建立了靈敏、快速、高效的兩步高通量篩選法。以split-GFP為報(bào)告基因結(jié)合定向進(jìn)化手段構(gòu)建突變文庫(kù),與以全長(zhǎng)增強(qiáng)型GFP(EGFP)為報(bào)告基因相比,有效地降低了篩選過(guò)程中的熒光背景和假陽(yáng)性程度,陽(yáng)性突變率從88%提高至95%。根據(jù)熒光強(qiáng)度與酶活力/蛋白濃度之間良好的線性關(guān)系,通過(guò)流式細(xì)胞分選儀從庫(kù)容量不小于10~4的突變文庫(kù)中初篩得到可溶性表達(dá)提高的突變株,對(duì)初篩目的菌株進(jìn)行酶活力復(fù)篩;(3)篩選獲得了可溶性表達(dá)和酶活力同時(shí)提高的突變株。通過(guò)兩步高通量篩選得到了2株優(yōu)勢(shì)突變菌株EP1和EP2,分別含有4個(gè)氨基酸突變位點(diǎn):I8V/I51V/F127I/E170D、V17G/H22R/K92N/I158K。可溶性蛋白含量是野生型的2倍左右,純化后的突變酶EP1和EP2的比活力分別是野生型的3.14、3.2倍左右。通過(guò)定點(diǎn)突變篩選得到突變株I51V、E170D和I51V/E170D的粗酶活分別是野生型的2.35、2.46、4.5倍。對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)分別構(gòu)建小型飽和突變文庫(kù),篩選后進(jìn)行組合得到突變株I51L/E170D的酶活力是野生型的4.8倍左右。純化后突變酶I51V、E170D和I51L/E170D的比活力分別是野生型的6.86、10.01、14.86倍;(4)研究突變酶的一系列酶學(xué)性質(zhì)。突變酶均在70 ~oC時(shí)測(cè)定最大酶活性,突變后仍保持嗜熱性,且在高溫條件下更穩(wěn)定。突變酶的最適pH值均為8.0,且在微堿性環(huán)境下催化效果更佳。突變酶EP1和EP2的K_m值降低,說(shuō)明突變酶對(duì)底物的親和力增強(qiáng),k_(cat)/K_m值分別是原始酶的2.42、2.35倍,因此催化活性增強(qiáng)。突變酶I51V、E170D和I51L/E170D的K_m值提高,k_(cat)/K_m值分別是野生型Aaeo1的5.65、4.79、10.7倍,催化效率提高的主要原因可能是由于底物結(jié)合口袋的變化導(dǎo)致突變酶的催化能力的提高;(5)通過(guò)同源建模分析了Aaeo1突變體酶活提高的機(jī)制。蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)模擬顯示,推測(cè)E170D突變改變了Aaeo1的口袋。第170位點(diǎn)與活性位點(diǎn)Asp163的距離約為8.9?,第51位點(diǎn)與Ser62之間僅由一個(gè)β-sheet連接,可能會(huì)通過(guò)長(zhǎng)距離或短距離影響酶活力的變化。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q55
【圖文】：

目前關(guān)于耐熱機(jī)制的提出大致可總結(jié)為：(1) 熱穩(wěn)定性是內(nèi)在的[6]。通過(guò)比和常溫菌的蛋白質(zhì)氨基酸組成的比較，發(fā)現(xiàn)嗜熱菌蛋白質(zhì)中 Ala、Pro、Arg、均高于常溫菌，而 Asn、Gln、Cys、Trp、Val、Ile 的含量顯著低于常溫菌；質(zhì)的耐熱性[7]。高溫環(huán)境下的菌的 GC 百分比高，那么意味著解鏈所需的溫度3) 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的空間相互作用[8]，如非共價(jià)力等。嗜熱蛋白酶離子結(jié)合位點(diǎn)離子(Ca2+、Mg2+等)起到促熱穩(wěn)定作用。隨著基因工程的出現(xiàn)和迅速發(fā)展，從種篩選、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)的研究到結(jié)構(gòu)分析、催化機(jī)制、基因改造等方面究，開(kāi)發(fā)了嗜熱酯酶在其他方面的應(yīng)用價(jià)值。 嗜熱酯酶的分子改造.1 理性和非理性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的區(qū)別蛋白質(zhì)的改造可以分為理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)，兩者之間的不同主要集中在以面：(1) 非理性設(shè)計(jì)不需要掌握關(guān)于酶的結(jié)構(gòu)和機(jī)制；(2) 理性設(shè)計(jì)適合二級(jí)結(jié)域的研究；(3) 非理性設(shè)計(jì)需要選擇策略；(4) 理性設(shè)計(jì)無(wú)點(diǎn)突變偏好性�；谀艿男畔⑦x擇酶改造策略如圖 1-1 所示：

實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌系統(tǒng)的異源表達(dá)，可溶性重組蛋白含量少且酶活力尚低，無(wú)法滿足工業(yè)需求。因此，就如何改善嗜熱酯酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)和催化活性這兩方面展開(kāi)探究。論文研究思路按圖 1-2 所示，通過(guò)優(yōu)化的 epPCR 條件對(duì)嗜熱酯酶基因任意位置插入突變，對(duì)于分子量為 24 KDa 的嗜熱酯酶基因來(lái)說(shuō)，具有高催化活力的目的轉(zhuǎn)化子的獲得，需要構(gòu)建一個(gè)庫(kù)容量不小于 104的突變文庫(kù)。為了解決大部分嗜熱酯酶表現(xiàn)為不可溶形式和酶活力低的問(wèn)題，首先嘗試了融合 EGFP 標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)可視化分析，發(fā)現(xiàn)以 EGFP為報(bào)告基因會(huì)造成篩選過(guò)程中的假陽(yáng)性。為了解決這一問(wèn)題，基于 split-GFP 為報(bào)告基因并結(jié)合定向進(jìn)化手段構(gòu)建突變文庫(kù)，通過(guò)流式細(xì)胞分選儀對(duì)文庫(kù)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高通量的初步篩選。根據(jù)熒光強(qiáng)度與酶活力/蛋白濃度之間的線性關(guān)系，通過(guò)測(cè)定全細(xì)胞熒光值獲得可溶性表達(dá)水平顯著提高的突變株，之后對(duì)初篩目的菌株進(jìn)行酶活力的二次篩選。兩步高通量篩選后得到可溶性表達(dá)水平和催化活力同時(shí)提高的優(yōu)勢(shì)菌株，然后利用定點(diǎn)突變分析突變位點(diǎn)，將優(yōu)勢(shì)突變位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變建立小型文庫(kù)以期得到酶活力進(jìn)一步提高的菌株。對(duì)篩選得到的突變酶進(jìn)行分離純化后進(jìn)行一系列酶學(xué)性質(zhì)研究。最后，嘗試通過(guò)同源建模分析突變酶活力提高的機(jī)制。

圖 2-1 split-GFP 體內(nèi)自組裝系統(tǒng)(a) GFP 分為 3 段: GFP1-9、GFP10 and GFP11; (b) split-GFP 之間的熒光互補(bǔ)原理；Fig.2-1 Split-GFP complementation assay in vivo. (a) The GFP was divided into 3 fragments; (b) Principleof the split-GFP complementation assay. The Aaeo1 gene was inserted between GFP10 and GFP11. Whenthe detector fragment GFP1-9 was added, GFP10-Aaeo1-11 could spontaneously assemble with GFP1-9fragment to form GFP with fluorescence emission.2.2.5 突變文庫(kù)的構(gòu)建以 pET28a-Aaeo1 為模板，通過(guò)引物 EPA11F 和 EPA11R，按照優(yōu)化后的 epPCR 條件進(jìn)行突變片段的擴(kuò)增，上下游分別選擇 BamHI 和 EcoRI 酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。EPA11F：5'-GCGGATCCATGCTGAAGAAC-3'EPA11R：5'-TTCGAATTCATACCCCTTTAAAATAGCTTT-3'50 μL epPCR 擴(kuò)增體系：5 μL 10×epPCR buffer, 2.5 mmol·L-1dNTP, 100 mmol·L-1dCTP/dTTP, 20 mg·mL-1MgCl2, 1 mg·mL-1MnCl2, 20 μmol·L-1F/R, 2.5 U rTaq, 1 μL DNAddH2O 補(bǔ)齊至 50 μL。

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